IVF实验室的基本操作

IVF实验室的基本操作演示文稿第1页，共36页。IVF实验室的基本操作第2页，共36页。实验室操作原则

防止污染配子标本的标记；受精、胚胎移植；

两人核对毒性测试；培养液、耗材的使用；实验室的质量控制和管理无误无菌无毒第3页，共36页。辅助生殖技术基本操作配子、胚胎培养系统1配子的收集和处理2体外受精技术3胚胎培养和移植4胚胎冷冻和解冻5第4页，共36页。培养液的准备培养液的基本组分无机盐离子---维持pH和渗透压碳水化合物---能量来源蛋白质来源抗生素矿物油有利于维持培养液温度、pH值和渗透压稳定防护屏障，减少污染吸收脂溶性毒素防止液体蒸发第5页，共36页。培养液的准备取卵前一日下午进行原则：高效、方便、安全、经济四孔培养皿—卵处理精液所需培养液微滴培养—受精卵、胚胎胚胎移植液37℃，5%或6%CO2培箱内平衡过夜第6页，共36页。卵母细胞的获取注射hCG后36-38小时取卵阴道超声探头引导下经阴道穿刺抽吸卵泡核对姓名解剖显微镜下辨认卵冠丘复合物OCCC37℃,5－6%CO2

培养操作迅速，避光第7页，共36页。精液处理正常精液：同IUI极度少精：增加离心力死精症：低渗肿胀实验附睾穿刺精子：睾丸穿刺或活检精子：

1ml注射器针头挑碎组织，离心悬液附睾、睾丸精子的冷冻第8页，共36页。常规受精

取卵后4-8h

适应症：精液正常，轻度少、弱精症受精率：65－80％（MII卵）受精时间：长受精、短受精第9页，共36页。第10页，共36页。卵母细胞浆内单精子显微注射适应症：严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往IVF常规受精失败史、某些不明原因不孕等时间：取卵后2小时剥卵：利用透明质酸酶（80mIU/ml)和机械法剥除颗粒细胞第11页，共36页。卵母细胞浆内单精子显微注射卵母细胞成熟度的评价GVMIMII第12页，共36页。卵母细胞浆内单精子显微注射操作滴的准备：7％PVP加精装针显微注射受精率：70％第13页，共36页。受精方式的选择ICSI的安全性？逃避了自然选择过程垂直传递遗传缺陷操作过程对配子的损伤严格掌握ICSI适应症第14页，共36页。非男性因素不孕ICSI治疗结局非男性因素不孕症，ICSI未显现出优势第15页，共36页。检查受精时间：受精后15－18小时机械法除去颗粒细胞及放射冠正常受精：两个原核，两个极体第16页，共36页。第17页，共36页。第18页，共36页。合子形态评价原核的大小、位置及方向核仁前体的数目、大小、分布胞浆的外观早期卵裂情况第19页，共36页。异常受精－1PN发生率1－5％卵裂率74%染色体二倍体率5％囊胚形成率29%(Noyes2008)机制：雌雄原核发育不同步雌雄原核融合孤雌来源ICSI多见第20页，共36页。异常受精－多PN发生率：IVF5-8%ICSI1%发生机制：

2精子进入第2极体滞留双倍体卵母细胞第21页，共36页。未见原核－未受精可能机制

卵母细胞未成熟卵母细胞染色体异常卵裂率<10%

染色体二倍体率3%优胚率低(12/38)囊胚形成(0/12)(Noyes2008)

第22页，共36页。受精失败受精率<20%受精率低下所有成熟卵均未受精受精失败常规受精周期失败率10％精子功能障碍卵母细胞成熟障碍补打ICSI?ICSI周期失败率2－3％严重精子畸形卵母细胞激活钙离子载体？机械激活？

第23页，共36页。胚胎培养第24页，共36页。胚胎质量评价胚胎评价标准细胞数碎片:无碎片碎片<10%

碎片10－30％碎片30－50％碎片>50%

卵裂球均匀程度

第25页，共36页。囊胚的评分体系4AA囊胚腔的大小内细胞团细胞分级滋养层分级三位评分法1:不到整个胚胎的一半2:超过了胚胎体积的一半3:完全占据整个胚胎4:扩张囊胚5:孵化囊胚6:孵化后囊胚A包裹紧密，大量细胞B结构松散，少量细胞C极少量细胞A许多细胞紧密结合B少量细胞，结构松散C极少量细胞第26页，共36页。

2AA5AA4BA4CC第27页，共36页。胚胎移植操作选择需要移植的胚胎,移入移植滴内

35岁以下，首次移植的病人移植2枚胚胎

35岁以上，或非首次移植的病人移植3枚胚胎确认核对患者姓名D3orD5移植？第28页，共36页。移植液移植液移植液和胚胎气～20μl 气胚胎移植操作第29页，共36页。胚胎冷冻意义：提高累计妊娠率，避免多胎，减少卵巢过度刺激风险温度的急剧变化形成冰晶机械性损伤溶质性损伤渗透压损伤核心：避免冰晶形成冷冻方法：慢冻速融法玻璃化冷冻法冷冻保护剂渗透性保护剂：EGPRON甘油非渗透性保护剂：蔗糖大分子物质第30页，共36页。胚胎的冷冻:慢速冷冻室温15min室温5min室温15minPBS1.5M丙二醇1.5M丙二醇0.1M蔗糖第31页，共36页。慢冻速融法冷冻程序

20℃→－7℃3℃/min-7℃人工植冰

-7℃→－30℃0.3℃/min-30℃→－120℃30℃/min第32页，共36页。胚胎复苏12340.5M丙二醇0.2M蔗糖

5min0.2M蔗糖

5minPBS5min1.0M丙二醇0.2M蔗糖5min预防冰晶的再形成复苏程序：室温40s→30℃水浴1min第33页，共36页。胚胎冻融损伤复苏胚胎评价：>50%卵裂球完整存活