《基因工程的基本操作程序》课件

第2节基因工程的基本操作程序第3章基因工程抗虫棉

1997年，我国政府首次批准商业化种植转基因抗虫棉。到2015年，我国已育成转基因抗虫棉新品种有100多个，减少农药用量40万吨，增收节支社会经济效益450亿元。从社会中来转基因抗虫棉（使棉铃虫死亡，左）与非转基因抗虫棉（右）

培育转基因抗虫棉主要需要四个步骤：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。

第一步：目的基因的筛选与获取1．目的基因概念在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。根据不同的需要，目的基因是不同的，它主要是指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、生产药物、毒物降解、工业用酶等相关的基因。Bt抗虫蛋白毒性机理Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因掌握了Bt基因的序列信息对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解苏云金杆菌的杀虫作用与Bt基因有关用苏云金杆菌制成的生物杀虫剂广泛用于防治棉花害虫已有多年历史

第一步：目的基因的筛选与获取2．筛选合适的目的基因

从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。随着测序技术的发展，以及序列数据库（如GenBank）、序列比对工具（如BLAST）等的应用，越来越多的基因的结构和功能为人们所知，这也为科学家找到合适的目的基因提供了更多的机会和可能。

思考：科学家为什么筛选Bt基因作为转基因抗虫棉的目的基因？

第一步：目的基因的筛选与获取3．利用PCR获取和扩增目的基因

⑴PCR概念即聚合酶链式反应，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

⑵

PCR反应条件

①反应环境：缓冲溶液，提供合适的酸碱度和某些离子（如Mg2+）。

②DNA母链：含目的基因，提供DNA复制的模板。

③引物：2种，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。

④原料：四种脱氧核苷酸。⑤酶：耐高温的DNA聚合酶，如Taq酶。注：PCR中解旋用高温代替。激活真核细胞和细菌的DNA聚合酶单链DNA或单链RNA

第一步：目的基因的筛选与获取3．利用PCR获取和扩增目的基因

⑶PCR获取和扩增目的基因的过程

PCR每次循环一般可以分为变性、复性和延伸三步：变性（90℃以上）使DNA双链解旋

↓冷却复性（50℃左右）引物与模板链结合

↓加热延伸（72℃左右）DNA新链由5′端向3′端延伸

上述过程可以在PCR扩增仪（PCR仪）中自动完成。

⑷目的基因的鉴定

常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。

第一步：目的基因的筛选与获取

/////////用PCR可以扩增mRNA吗？/////////

mRNA不可以直接扩增，需要将它逆转录成cDNA再进行扩增。由mRNA逆转录形成cDNA的过程是：第一步，逆转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA链，形成RNA-DNA杂交分子；第二步，核酸酶H降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，使之变成单链DNA；第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子，如下图所示。单链RNA杂交双链单链DNA双链DNA逆转录酶核酸酶H(RNaseH)DNA聚合酶RNA链DNA链？

第二步：基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的

让基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代；同时使目的基因能够表达和发挥作用。

2．基因表达载体的组成重组DNA分子目的基因标记基因终止子复制原点是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因上游，紧挨转录的起始位点，是RNA聚合酶识别和结合的部位。启动子也是一段有特殊序列结构的DNA片段，位于基因下游，使转录在所需要的地方停下来。

第二步：基因表达载体的构建3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口；然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割含有目的基因的DNA片段；再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子。

第三步：将目的基因导入受体细胞

构建好的基因表达载体需要通过一定的方式才能进入受体细胞。

1．花粉管通道法——我国科学家独创

方法一：用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。

方法二：也可以在植物受粉后的一定时间内，剪去柱头，将DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道进入胚囊。

第三步：将目的基因导入受体细胞2．农杆菌转化法

⑴转化的概念指目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

⑵适用的生物主要是双子叶植物和裸子植物。

⑶原理农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。根据农杆菌的这种特点，如果将目的基因插入Ti质粒的T-DNA中，通过农杆菌的转化作用，就可以使目的基因进入植物细胞。

第四步：目的基因的检测与鉴定

目的基因进入受体细胞，是否稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。

1．分子水平的检测

⑴利用PCR等技术检测转基因生物的DNA中是否插入了目的基因。

⑵利用PCR等技术检测转基因生物的DNA中的目的基因是否转录出了mRNA。

⑶利用抗原－抗体杂交技术检测目的基因是否翻译出了蛋白质。

2．个体生物学水平的鉴定

对转基因生物进行抗性接种实验，检测其是否具有抗性及抗性程度；或比较基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同。小结：基因工程的基本操作流程图获取质粒、噬菌体等载体筛选和获取目的基因用限制酶切割载体和含有目的基因的DNA片段，然后用DNA连接酶连接，构建基因表达载体将含有目的基因的表达载体导入受体细胞检测和鉴定目的基因是否稳定维持和表达其遗传特性核心阅读教材P77、P82页相关内容，分析基因工程基本操作中获取目的基因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。

1．获取目的基因的方法

⑴利用DNA合成仪人工合成目的基因的方法适合长度较小的基因。

⑵利用PCR获取和扩增目的基因的方法，既可以扩增已得到的基因或DNA片段，也可以用来扩增很长的DNA分子中的目的基因。用该方法的前提是“要有一段已知目的基因的核苷酸序列”，即要知道目的基因边界的碱基序列作为引物。

⑶通过构建基因文库来获取目的基因，基因文库包括基因组文库（包含了一种生物的所有基因）和cDNA文库（包含了一种生物的部分基因，其基因是通过“反转录法”获得的）。科学思维训练科学思维训练阅读教材P77、P82页相关内容，分析基因工程基本操作中获取目的基因的方法、将目的基因导入受体细胞的方法。

2．将目的基因导入受体细胞的方法

⑴受体细胞为植物细胞

花粉管通道法；农杆菌转化法。

⑵受体细胞为动物细胞

将目的基因导入动物受精卵最常用的一种方法是利用显微注射将目的基因注入动物的受精卵中。

⑶受体细胞为原核生物

如以大肠杆菌为受体细胞，先用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将重组的基因表达载体导入其中。拓展应用

八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。

⑴科学家在培育“黄金大米”时，将crtⅠ和psy基因导入含pmi基因的质粒中，构建了质粒pSYN12424。该项研究的目的基因是______________，标记基因是_________,质粒pSYN12424的作用crtⅠ和psy基因pmi基因是_______________________。将目的基因导入受体细胞拓展应用

八氢番茄红素合酶（其基因用psy表示）和胡萝卜脱饱和酶（其基因用crtⅠ表示）参与β-胡萝卜素的合成。pmi为磷酸甘露醇异构酶基因，它编码的蛋白质可使细胞在特殊培养基上生长。科学家将psy和crtⅠ基因转入水稻，使水稻胚乳中富含β-胡萝卜素，由此生产出的大米称为“黄金大米”。请根据以上信息回答下列问题。⑵在构建质粒载体时，目的基因序列中能否含有用到的限制酶的识别序列？为什么？不能。如果目的基因序列中含有限制酶的识别序列，则限制酶可能会将目的基因破坏。1234567891011121314A级必备知识基础练1.利用PCR技术从某种生物的基因组DNA中获取目的基因。有关这一过程,下列说法错误的是(

)A.以含有目的基因的DNA片段作为模板B.目的基因的一段核苷酸序列已知,以便根据这一序列合成两种引物C.有足够的脱氧核苷酸作为原料D.加入足够数量的DNA连接酶进行指数式扩增D1234567891011121314解析

用PCR技术扩增目的基因,应以含有目的基因的DNA片段作为模板,A项正确;PCR技术的前提条件是目的基因的一段核苷酸序列已知,以便合成一对引物,B项正确;DNA复制需要有足够的脱氧核苷酸作为原料,C项正确;PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶,不需要加入DNA连接酶,D项错误。12345678910111213142.对RNA病毒进行检测时可以采用实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)的方法,RT-PCR的具体过程如图。下列叙述错误的是(

)A.过程①以mRNA为模板合成单链DNAB.过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,理论上需要n个引物BC.游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接D.该技术用于对某些微量RNA病毒的检测,可提高检测的灵敏度B1234567891011121314解析

过程①是由mRNA形成单链DNA的过程,表示逆转录,A项正确;过程②③拟对单链cDNA进行n次循环的扩增,根据DNA分子半保留复制特点可知,该过程理论上至少需要2n-1个引物B,B项错误;游离的脱氧核苷酸只能从引物的3'端开始连接,C项正确;利用实时荧光RT-PCR技术对某些微量RNA病毒进行检测时可提高检测的灵敏度,是因为增加了待测RNA逆转录产生的DNA的数量(或浓度),D项正确。12345678910111213143.PCR技术是在DNA聚合酶的作用下,在体外进行DNA大量扩增的一种分子生物技术。下列叙述正确的是(

)A.双链DNA在高温下氢键和磷酸二酯键断裂形成2条DNA单链B.温度降低后,单链DNA和引物结合的部分碱基序列相同C.以2条DNA单链为模板,以4种NTP为原料,经耐高温酶在高温下合成2个新的DNAD.设置PCR仪的温度进行反应可重复循环多次,DNA呈指数式扩增D1234567891011121314解析

双链DNA在高温下解旋即DNA双链打开,断裂的是碱基对之间的氢键,而磷酸二酯键没有断裂,A项错误;当温度降低时,引物与模板末端结合,单链DNA和引物结合的部分碱基序列互补,B项错误;以2条DNA单链为模板,以4种dNTP为原料,在耐高温DNA聚合酶的作用下合成2个新的DNA,C项错误;PCR的反应步骤为目的基因DNA受热变性后解链为单链,引物与单链相应互补序列结合,然后在热稳定DNA聚合酶的作用下进行延伸,如此重复循环,因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍,即呈指数形式扩增(约为2n,其中n为扩增循环的次数),D项正确。12345678910111213144.关于基因表达载体构建的叙述,下列说法不正确的是(

)①一个基因表达载体的组成只包括目的基因、启动子、终止子②有了启动子才能驱动基因转录出mRNA

③终止子的作用是使转录在所需要的地方停止④所有基因表达载体的构建都是完全相同的A.②③

B.①④C.①②

D.③④B1234567891011121314解析

基因表达载体的结构包括目的基因、标记基因、启动子、终止子等,①错误;有了启动子才能驱动基因转录出mRNA,②正确;终止子的作用是使转录在所需要的地方停止,③正确;不同基因表达载体的构建不一定相同,④错误。12345678910111213145.在重组DNA技术中,将外源基因导入受体细胞,通常是利用质粒作为载体。下列关于质粒的叙述,正确的是(

)A.质粒是一种只存在于原核细胞中的结构简单的环状DNA分子B.目的基因直接导入受体细胞则难以在受体细胞中表达C.目的基因只有通过质粒整合到受体细胞的DNA中才能表达D.大多数天然质粒都不需要人工改造,可以直接作为载体使用B1234567891011121314解析

质粒是存在于许多细菌以及酵母菌(真核细胞)中的有自主复制能力的小型环状DNA分子,A项错误;载体中含有启动子、终止子等元件,可以调控目的基因的表达,因此必须构建基因表达载体,才能保证目的基因的表达,B项正确;目的基因无需整合到受体细胞的DNA中,只需要将含有目的基因的质粒导入受体细胞就能表达,C项错误;天然的质粒不能直接作为载体,基因工程中用到的质粒都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的,D项错误。12345678910111213146.在基因工程的操作过程中,获得重组质粒不需要(

)①DNA连接酶②限制酶③RNA聚合酶④具有标记基因的质粒⑤目的基因⑥四种脱氧核苷酸A.③⑥

B.②④C.①⑤

D.①②④A解析

构建重组质粒时,首先要用限制酶切割含有目的基因的DNA片段和质粒,其次需要用DNA连接酶将目的基因与质粒连接;RNA聚合酶催化转录过程,获得重组质粒时不需要RNA聚合酶;获得重组质粒时,需要具有标记基因的质粒作为载体;重组质粒是由目的基因与质粒共同形成的;四种脱氧核苷酸是合成DNA的原料,获得重组质粒不需要四种脱氧核苷酸。12345678910111213147.某研究所的研究人员将生长激素基因通过质粒介导进入大肠杆菌细胞内,来表达产生生长激素。已知质粒中存在两个抗性基因:A是抗链霉素基因,B是抗氨苄青霉素基因,且目的基因要插入基因B中,而大肠杆菌不带有任何抗性基因。下列叙述正确的是(

)A.导入大肠杆菌的质粒一定为重组质粒B.研究过程需要使用限制酶、DNA连接酶和载体这些专门的工具酶C.可用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒D.在含链霉素培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌D1234567891011121314解析

导入大肠杆菌的质粒可能为重组质粒,也可能为普通质粒,A项错误;构建基因表达载体过程中需要限制酶和DNA连接酶,载体不属于酶,B项错误;由于目的基因要插入基因B中,即抗氨苄青霉素基因被破坏,即工程菌不能抗氨苄青霉素,因此不能用含氨苄青霉素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒,C项错误;重组质粒中抗氨苄青霉素基因被破坏,而抗链霉素基因完好,因此在含链霉素的培养基中能生长的可能是符合生产要求的大肠杆菌,D项正确。12345678910111213148.环境雌激素(EEs)会影响动物和人类的性腺发育。斑马鱼在EEs的诱导下,会表达出卵黄蛋白原(vtg)。已知绿色荧光蛋白(GFP)基因能使斑马鱼发光,欲获得能检测水中是否含有EEs的转基因斑马鱼,下列操作合理的是(

)A.将EEs基因的启动子与GFP基因重组B.将vtg基因的启动子与GFP基因重组C.将GFP基因的启动子与GFP基因重组D.将GFP基因的启动子与vtg基因重组B1234567891011121314解析

由题意可知,环境中的EEs可诱导斑马鱼体内vtg基因的表达,在不含EEs的环境中,斑马鱼体内vtg基因不能表达。因此,只要将vtg基因的启动子与GFP基因重组并导入斑马鱼体内,便能根据斑马鱼是否发光检测水中是否含EEs。12345678910111213149.DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因(如图甲)插入适宜的质粒(如图乙)中得到的重组DNA分子,将其导入人体内,在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫应答,且可持续一段时间。限制酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点如下图所示。下列分析正确的是(

)1234567891011121314A.构建DNA疫苗时,可用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和质粒B.图乙中只用EcoRⅠ切割质粒产生的DNA片段具有相同平末端C.用EcoRⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA聚合酶连接,会产生多种连接产物D.抗原基因在体内表达时,需要经过转录和翻译过程,会发生氢键断裂和形成答案

D1234567891011121314解析

外源DNA分子和质粒上都含有3种限制酶(BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ)的切割位点,为了防止目的基因和载体的自身环化和两者之间的不定向连接,因此可用BglⅡ和Sau3AⅠ两种限制酶进行切割,A项错误;EcoRⅠ切割后获得的是黏性末端,B项错误;用EcoRⅠ切割目的基因和质粒,再用DNA连接酶连接,能产生多种连接产物,如目的基因自身环化、质粒自身环化、目的基因与质粒正向连接、目的基因与质粒反向连接等产物,C项错误;抗原基因在体内表达时,需要经过转录和翻译过程,会发生氢键断裂(解旋)和形成,D项正确。123456789101112131410.请回答下列相关基因工程中构建基因表达载体的问题。(1)培育转基因植物过程的核心步骤是构建基因表达载体,其目的是使目的基因在受体细胞中

,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。

(2)构建基因表达载体时,可利用

酶连接被限制酶切开的

键。

(3)组成基因表达载体的单体是

。基因表达载体中的启动子是

识别和结合的部位,在结合完成后才能驱动目的基因通过

(填过程)合成mRNA。目的基因表达的翻译过程的终止信号是

。

稳定存在DNA连接磷酸二酯脱氧核苷酸RNA聚合酶转录终止密码子1234567891011121314解析

(1)构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以通过复制遗传给下一代,同时,使目的基因表达和发挥作用。(2)DNA连接酶的作用是在DNA片段之间形成磷酸二酯键。(3)基因表达载体的本质是DNA,其基本组成单位是脱氧核苷酸;基因表达载体中的启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,在结合完成后才能驱动目的基因通过转录合成mRNA。目的基因表达的翻译过程的终止信号是终止密码子。1234567891011121314B级能力素养提升练11.像BclⅠ(5'-T↓GATCA-3')、BglⅡ(5'-A↓GATCT-3')、MboⅠ(5'-↓GATC-3')这样,识别序列不同、但能产生相同的黏性末端的一类限制酶被称为同尾酶。下图表示目的基因及质粒上的酶切位点。选用不同的限制酶对质粒和目的基因进行切割,并用DNA连接酶进行连接。下列分析错误的是(

)1234567891011121314选项切割质粒切割目的基因结果分析ABclⅠ和BglⅡBclⅠ和BglⅡ形成的重组质粒的碱基排列顺序不一定相同BBclⅠ和BglⅡMboⅠ切割后的质粒不可自身环化,切割后的目的基因可以自身环化CMboⅠBclⅠ和BglⅡ形成的重组质粒可被MboⅠ再次切开,但可能无法被BclⅠ和BglⅡ再次切开DMboⅠMboⅠ切割后的质粒可以自身环化,切割后的目的基因也可以自身环化答案

B1234567891011121314解析

切割质粒和切割目的基因均用BclⅠ和BglⅡ,由于两种酶切割后产生的黏性末端相同,形成重组质粒时目的基因可能反向连接,形成的碱基排列顺序不一定相同,A项正确。切割质粒用BclⅠ和BglⅡ,切割后产生的黏性末端相同,切割后的质粒可能自身环化;切割目的基因用MboⅠ,切割后产生黏性末端,切割后的目的基因可以自身环化,B项错误。切割质粒用MboⅠ,产生黏性末端,切割目的基因用BclⅠ和BglⅡ,产生黏性末端,形成的重组质粒中原来的BclⅠ和BglⅡ的切割位点的序列发生改变,不能再被这两种酶切割,但不影响MboⅠ的作用,C项正确。切割质粒用MboⅠ,切割目的基因用MboⅠ,产生的均为黏性末端,切割后的质粒可自身环化,切割后的目的基因也可以自身环化,D项正确。123456789101112131412.[多选]蜘蛛丝是天然蛋白纤维,其机械性能高于常用于制作防弹衣的凯夫拉纤维,有广泛的应用前景。中国科学家利用质粒(如图)成功构建了蛛丝蛋白基因的重组质粒,并在家蚕丝腺细胞中获得大量蛛丝蛋白。下列有关说法正确的是(

)1234567891011121314A.为防止目的基因自身环化,可以用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因B.构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达C.启动子是RNA聚合酶的识别和结合部位,可以驱动遗传信息的复制和转录D.基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞答案

ABD1234567891011121314解析

用限制酶XbaⅠ和SacⅠ来切割目的基因,可以使目的基因两端产生不同的黏性末端,防止目的基因自身环化,A项正确;为了能从家蚕丝腺细胞中提取蛛丝蛋白,基因表达载体中目的基因的上游必须含有使其能在家蚕丝腺细胞中转录的启动子,即构建表达载体时选用蚕丝蛋白基因的启动子利于基因在家蚕丝腺细胞中表达,B项正确;启动子只能驱动基因转录,不能驱动其复制,C项错误;基因表达载体中的标记基因可以鉴别与选择含有蛛丝蛋白基因的受体细胞,D项正确。123456789101112131413.[多选]科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术,检测原理(a、b)及结果(c)如下图。下列叙述错误的是(

)1234567891011121314A.需要针对不同病原体设计特异性引物和荧光探针B.图中b是PCR反应的复性过程C.多重PCR同时完成对4种病原体的检测D.由结果推测该检测样品中有B、C、D病原体的核酸答案

BD1234567891011121314解析

不同的病原体的碱基序列是不同的,因此需要根据病原体的碱基序列设计不同的特异性引物和荧光探针,A项正确;图中b是PCR反应的延伸过程,该过程会合成新的子链,B项错误;科研人员在常规PCR基础上发展出同时检测多种病原体的多重PCR技术,由图c可知,多重PCR同时完成对(A、B、C、D)4种病原体的检测,实验组中B、C、D的剩余探针荧光强度与阴性对照组相似,说明该检测样品中没有B、C、D病原体的核酸,实验组中A的剩余探针荧光强度与阴性对照组不同,说明该检测样品中有A病原体的核酸,C项正确,D项错误。1