微生物检测步骤

微生物操作流程

1培养基制备：按培养基标签使用量，用滤纸称量培养基至三角瓶中，放置电

炉(加石棉网)加热至沸腾取下；加热时用玻璃棒搅拌防止糊底。乳糖胆盐发酵

培养基用刻度吸管或移液密取5()ml(也可以加l()ml培养基，后续加入样品液对

应为1ml)加入试管中，加小倒管，小倒管中不能有气泡，盖上管塞。

0.9%生理盐水制备：取氯化钠9g加蒸锵水991g,搅拌至氯化钠全部溶解，配制

成0.9%生理盐水。

实验用水：蒸储水

2灭菌：将盛装培养基和生理盐水的三角瓶口，镶子、剪刀、移液器枪头、乳

糖发酵管用报纸包扎，乳糖发酵管放入烧杯，放入高压蒸汽灭菌器灭菌121度

3()min,灭菌后通过传递窗传入无菌室，用酒精喷壶对表面消毒后放置在不锈钢

台上。

3传递窗使用规则：使用前后要开启紫外杀菌30min,传递窗两侧门严格执行

一开一美，严禁同时打开。

4无菌室使用前对无菌室紫外灭菌30min,开启空气净化》Ih,使用时提前

30min关掉紫外，洁净台紫外灭菌30min；使用时关掉紫外，开启排风系统。

5无菌室进出流程：一更换鞋或者带鞋套，二更更换实验服，缓冲间洗手消毒

后进入无菌室，进入无菌室后尽量少走动。

7打开洁净台排风系统，用75%酒精擦拭操作台面消毒，将传递窗传递进入物

品及一次性培养皿放入洁净台。

8样品制备及无菌操作(在洁净台中操作)：

样品液制备：用酒精喷壶对手部消毒，从均质袋底部取出均质袋，不要碰触袋子

开口，打开袋子放在天平上的大烧杯里，剪刀用酒精棉球消毒后剪取样品10±lg,

加入生理盐水200g,将袋子口折叠拍打揉搓样品约60下。如需对样品进行襦释,

用移液器吸取1ml制备液，放入9nli无菌生理盐水中，就稀释为10倍，以此类

推。(卫材一般不需要再稀释)

无菌操作：

①细菌菌落总数和真菌菌落总数操作，用移液枪取1ml所需浓度样品液加

入平皿中，加入时，平皿不能完全打开，仅开启一半小口加入样品即可，倒入

15-2()ml培养基，半皿在桌面旋转混匀，分别做3个培养皿，凝固后从传递窗传

递至培养间，培养皿倒置放入培养箱培养，一摞可放置8-10个培养皿，避开培

养箱通风口，放置培养基水分过度流失。

②大肠菌群操作，取下乳糖发酵管塞，用移液枪取5ml所需浓度样品液加

入乳糖发酵管中，盖好管塞。

③空白对照：另取新的枪头吸取1ml灭菌生理盐水加入平皿中，倒入培养

基，分别做细菌菌落总数和真菌菌落总数空白培养皿；吸取1ml灭菌生理盐水加

入乳糖发酵管中，做大肠菌群空白对照。

9培养条件:

检验项目培养温度培养周期观察记录

35度

细菌2天每天观察菌落

35度

大肠杆菌1天培养基浑浊，小倒管有气泡(阳性)

25度

真菌7天在第3、5、7每天观察菌落

10菌落计数：平皿生长菌落平均数乘以稀释倍数(20),单位cfu/g

11标准

产品^200cfu/g

空气落菌^2500cfu/m3

工作台表面W20cfu/cm2

工人手表面W300cfu/只手

无菌室3沉降菌/皿

洁净台1沉降菌/皿

其他检测

1手部检测：用浸在10ml生理盐水中的灭菌棉签，在五指指尖到指端来回涂擦

10次，剪去手接触部分棉签，将棉签放入10ml灭菌生理盐水试管中，混匀，取

1ml加平皿加培养基，剪刀要灭菌或用酒精棉消毒。

菌落计数：平皿生长菌落数乘以10,单位cfu/只手

2T作设备台面：用浸在10ml牛理盐水中的灭菌棉签，涂抹5cm*5cm面积表面

1()次，剪去手接触部分棉签，将棉签放入l()ml灭菌生理盐水试管中，混匀，取

1ml加平皿加培养基，剪刀要灭菌或用酒精面消毒。

菌落计数：平皿生长菌落数乘以10除以面积，单位cfu/cm2

3空气落菌：事先准备细菌菌落总数培养基35度培养24h,检查无污染，在待

检处打开平皿盖,放置5min,35度培养4皿观察

菌落计数：平皿生长菌落数乘以50000除以平皿面积、时间，单