CN114667450B 用于色谱介质的使用和再生的系统及方法 （里珍纳龙药品有限公司）

2022.06.242022.04.25PCT/US2020/0522432020.09.23WO2021/061790EN2021.04.01本公开的多个方面涉及一种使已向其中加该方法包括使一个或多个柱体积的碱性溶液通和约10mS/cm之间的电导率，其中将结合到疏水该碱性溶液可以以在例如约0.1mM和10mM之间的2使一个或多个柱体积的碱性溶液通过在所述柱内部的疏水相性溶液显示在10和14之间的pH值及在0.5mS/cm和10mS/c3.如权利要求1所述的方法，其中所述碱性溶液显示在0.8mS/cm和1.6小于1.0％的所述进样物质作为残留物仍然结合于所述8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括使所述疏水相互作用介质与离液剂9.如权利要求1所述的方法，其中使所述一个或多个柱体积的碱性溶液通过在所述柱3[0002]本申请要求于2019年9月24日提交的美国临时专利申请第62/905,033号、及于[0004]色谱是一种广泛使用的工艺过程类型，可执行这些过程以分离混合物的各组分。进行分离。分子与HIC介质的疏水性表面之间的相互作用会受到例如流动缓冲液中的盐的度降低以逆转它们与HIC介质的疏水相互作4[0008]在结合到疏水相互作用介质包括细菌或真菌。在一些实施方案中，该方法可不包括使疏水相互作用介质与离液剂疏水相互作用介质的步骤用时约10分钟和质，其中第一溶液具有水及从约0N开始以大致恒定速率增大到最大浓度的碱性溶液浓度；始以大致恒定的速率减小到约0N的碱性溶液浓度；以及确定第一或第二溶液中的一部分，5[0012]并入本说明书中且构成本说明书的一部分的附图图解说明了各种示例性实施方[0018]图6描绘了根据本公开多个方面的、含有经历了多次疏水相互作用色谱循环的疏水相互作用介质的柱与含有未使用的疏水相互作用介质[0023]图11描绘了根据本公开多个方面的、其中已将具有逐渐增大/逐渐减小浓度的氢[0028]图16描绘了根据本公开多个方面的作为氢氧化钠浓度的函数的盐酸胍剥离液峰[0029]图17和图18描绘了根据本公开多个方面的各自包含多个再生溶液的对照再生过[0030]图19描绘了根据本公开多个方面的用于纯化不同单克隆抗体的疏水相互作用色[0031]图20A图20C描绘了根据本公开多个方面的利用包含三种不同疏水相互作用色谱6[0034]图23A图26C描绘了根据本公开多个方面的利用多个疏水相互作用色谱介质、pH[0035]图27A图28D描绘了根据本公开多个方面的利用多个疏水相互作用色谱介质、pH7区和VL区可以进一步被细分为超变区(称为互补决定区(CDR))，其中散布有更加保守的区的DNA的操作和表达的任何合适的标准技术(如蛋白酶酶切或重组基因工程技术)而由全抗序和操控，例如以将一个或多个可变和/或恒定结构域布置成合适的构型，或者导入密码8细胞死亡1抗体(例如，抗PD1抗体，如在美国专利申请公布第US2015/0203579A1号中所描015号中所描述)、抗补体5抗体(例如，抗C5抗体，如在美国专利申请公布第US2015/国专利第9,132,192号中所描述，或者抗EGFRvIII抗体，如在美国专利申请公布US2015/在美国专利第8,062,640号中所描述或在美国专利申请公布第US2014/0044730A1中所描描述)、抗分化簇3(例如，抗CD3抗体，如在美国专利申请公布US2014/0088295A1和9[0051]在一些实施方案中，目标分子是含有Fc部分和另一个结构域的重组蛋白(例如，水性程度可以通过选择疏水部分而加以控制。被称作疏水相互作用色谱(HIC)的过程使用疏水相互作用介质，用于从产品和过程相关污染物中分子和其他组分的混合物加到在缓冲液中的HIC介质中，该缓冲液被设计为促进目标分子HIC也可以以其中目标分子结合到HIC介质同时HCP和细胞碎片未能结合并流过的模式运再生可在不使HIC介质经历更强力的清洗液的情况下完成，这类清洗液可能具有不利的作对色谱介质或色谱装置进行消毒和/或杀菌的浓度和量使用抗菌、抗真菌、或抗微生物溶的使用，但再生的主要目的可以是在纯化过程之后从色谱介质中去除进样物质的残留组[0056]在HIC介质中的分子的分离可通过例如使HIC介质暴露于具有高盐浓度的进样物质以增加HIC介质与进样物质中的目标分子之间的疏水相互作用并且随后使具有增大或减案中，再生溶液可通常显示低电导率。例如，在一些实施方案中，再生溶液可显示在约物质加到在色谱柱中的HIC介质的一些实施方案中，根据本公开所用再生溶液的体积可以[0063]在一些实施方案中，本文中所公开的再生溶液和/或方法可适用于具有高度疏水文中所描述方法及再生溶液可适合用于连续(多柱)HIC系交的国际专利申请PCT/US2019/040148中所公开的，该专利申请的以引用的方式并入本文及再生溶液可用于包括低或无向药性条件的HIC系统[0064]在一些实施方案中，根据本公开的再生过程可在不使用反渗透去离子水(RODI)、0.05M和约0.15M之间的浓度的氢氧化用于对单元操作(如HIC)进行测试。在同时对用于[0070]对用于单元操作的方案进行评价的方法还可包括执行适合用于大规模工艺的洗脱和清洗步骤(例如，包括反渗透去离子水(RODI)可使用例如滴定到方案特定pH值的洗脱缓冲液而执行洗脱/清洗步骤。在对用于单元操作的不同孔内。洗脱步骤可包括例如使在过滤孔中加载的色谱介质暴露于梯度洗脱缓冲液度洗脱(pseudo_gradientelution)，其中使已结合到色谱介质的任何残留物的任何溶液。这种再生过程在本文中的其他地方进行描述，[0072]根据本公开的评价方法可包括测量在例如清洗/洗脱步骤和剥离步骤期间所回收回收率超过预定的阈值，那么可预测单元操作方案当被放大时和/或当重复许多次时潜在地引起再生/可复用性问题。如果在剥离步骤期间目标分子的百分回收率是处在或低于预定的阈值，那么可预测该单元操作方案当被放大和/或被重复时不引起再生/可复用性问选和/或洗脱试验)对多个HIC方案进行评价，并且预测会造成再生/可复用性问题的HIC方案可被排除或用于进一步研究的优先级后移。未被预测造成再生/可复用性问题的色谱方一些实施方案中，根据本公开的方法可有利地在早期帮助确定会防止再生/可用性问题的[0077]现在将参考具体附图。图1描绘了根据本公开多个方面的使色谱柱再生的方法将单种碱性再生溶液加到色谱柱中，以将结合到在色谱柱中疏水相互作用介质的物质去PS20降解百分比相当于没有可检测到的NEFA，并因此相当于没有可检测到的脂肪酶活性。0.47[0085]图2描绘了在各种使用状态中或者在暴露于再生溶液之后HIC介质(CaptoTM苯基[0091]图3描绘了在各种使用状态中或者在暴露于再生溶液之后HIC介质(CaptoTM苯基[0094]表3列出了所使用介质的类型以及该介质暴露于什么再生剂。如在图3中可以看[0098]图5描绘了在各种使用状态中或者在暴露于剥离液之后HIC介质(CaptoTMPhenyl*ABCDEFGHI[0103]图6描绘了含有CaptoTM苯基(HighSub)HIC介质(GELifeSciences公司)的两个[0106]图7A和图7B分别描绘了关于实施例6所描述的在左柱上执行的循环2和循环49的据均表明在氢氧化钠之前使用RODI不是有效的剥在第一过程中应用的第一次RODI剥离的电导率降低不引起任何可感知量的物质从色谱柱[0116]进一步对在图6中所描绘的6N盐酸胍作为剥离液及作为用于去除在左柱上的变色ABCDE[0122]详细地对再生范例进行了分析。图10A描绘了在期间利用ABCDEFGHI[0129]此过程表明当使～5mM氢氧化钠通过柱时从柱中洗脱的结合物质为最大，从而留在各再生过程中的6N盐酸胍溶液生成了第二峰，由用B标记的峰群表示。已确定包括5mM[0133]从用CaptoTM苯基(HighSub)介质(GEHealthcareLifeScienHIC柱中收集mAb4之后，对由再生过程生成的色谱图峰的曲线下面积(AUC)进行方差的单溶液(C_L)进行了再生过程。各再生过程包括剥离液(在图这些再生溶液流过期间生成的峰有最高的AUC值(圈在区域1300中)，从而表明这些再生溶程显示，在再生溶液之后6N盐酸胍溶液流过期间所生成的峰具有最低AUC值(圈在图13B的6N盐酸胍去除。因此，具有在0.5mM至5mMNaOH范围内的氢氧化钠浓度的溶液被证明对于HIC柱中收集单克隆抗体mAb5之后，使用3mM、5mM或7mM浓度的氢氧化钠，或者使用5mM、[0141]在经过50次HIC循环以纯化单克隆抗体mAb6的柱子上测试了潜在的清洗/再生方生溶液。各氢氧化钠溶液对纯化过程中所用HIC介质的再生效能(效果)是用加入各氢氧化钠溶液之后与6N盐酸胍剥离相关的色谱图峰的尺寸进行表征的。与胍剥离峰相关的较大较小AUC表明在剥离之前所用氢氧化钠溶液留下了较少量的残留物，并因此表明是更有效[0145]在从色谱柱中收集单克隆抗体mAb5之后在HIC柱上实施被设计成对照的第一再ABCDEFGH[0149]在从HIC柱中收集mAb5之后实施包含5mM氢氧化钠的第二再生过程，并且生成色谱图，将该色谱图描绘于图18。按以下顺序使用多个溶液：开始于5mM氢氧化钠，接着是1234415678N/A(不适用)[0152]如图18中所示及由上表中的AUC值所反映，最初5mMNaOH流过显示具有大边缘的对照过程(7,390mL*mAU)中的6N盐酸胍峰的AUC值相比在此再生过程中6N盐酸胍峰的较小[0154]在含有CaptoTMPhenyl(HighSub)介质(GELi[0159]对具有不同条件的多个HIC方案进行了评价以判定这种方案是否会造成再生/可[0166]2.将包含所期望目标抗体的进样物质在各自的pH下添加到各孔中并且保温达一的三种不同HIC介质(TOYOPEARL8Hexyl_650C、PhenylSepharose6FastFlow(High[0178]利用本文中所描述的高通量筛选技术对数据的集合使得预测功能的建立成为可media)在进样量100g/升介质时的高通量筛选数据的集合，将洗脱缓冲液柠檬酸盐浓度和苯基琼脂糖凝胶B介质的HIC方案。在该阴影区外部的pH与柠檬酸盐浓度的组合是用于给定抗体和苯介质的可变HIC方案参数，而在阴影区内部pH与柠檬酸盐[0180]图21B是基于给定抗体和CaptoTM苯基(HighSub)色谱介质在100g/升介质进样时的高通量筛选数据的集合、将洗脱缓冲液柠檬酸盐浓度和pH与HIC方案的预测产率联系起告知应考虑将什么柠檬酸盐和pH参数用于包含给定抗体和CaptoTM苯基(HighSub)介质的HIC方案。在阴影区外部的pH与柠檬酸盐浓度的组合是用于给定抗体和CaptoTM苯基(HighSub)介质的可变HIC方案参数，而在阴影区内部的pH与柠檬酸盐浓度的组合是被排除的参小规模试验或高通量筛选预测的产率)的一组的HIC方案，可通过全尺寸色谱确定各HIC方参照图22，图中显示了动态预测模型。该动态预测模型计算了对一个或多个HIC方案参数方案进行了测试，以判定这些组合是否会造成再生/可用性问题以及是否有些目标分子与HIC介质组合应当在进一步的HIC方案建[0190]2.将包含所需目标分子的进样物质在各自的pH下添加到各孔中并且保温达一小7(使用RODI和NaOH)期间被去除的物质中所观察到的目标分子的质量，并且第三区域包含在步骤8(使用6N盐酸胍)期间被去除的物质中所观察[0198]将从用于第一目标分子的洗脱试验中所生成色谱图的示例示于图23A一图26C图23A图23C示出了CaptoTM苯基(HighSub)介质上包含第一目标分子的洗脱试验的色谱[0199]将从用于第二目标分子的洗脱试验中所产生色谱图的示例示于图27A一图28D了来自在CaptoTM苯基(HighSub)介质上的洗脱试验运行的色谱图，图27B示出了来自在CaptoTM丁基介质上的洗脱试验运行的色谱介质上的洗脱试验运行的色谱图，图27D示出了来自在POROSTM乙基介质上的洗脱试验运行[0201]通过对给定目标分子的不同HIC方案的色谱图进行比较，可将某些HIC介质和/或的区域3目标分子回收率的示例性列表示于HIC方案开发。在一些实施方案中，如果对于给定目标分子的介质与pH组合的排除是必要