CN114729928B 用于在基于干涉测量术的生化测定中重复使用测试探针和试剂的方法 （万迈医疗仪器有限公司）

2022.04.02PCT/US2020/0545182020.10.07WO2021/071903EN2021.04.15用于在基于干涉测量术的生化测定中重复法在维持可接受的测定性能的同时重复使用半抗原固定的测试探针和试剂来对不同样品中的分析物进行定量或测量不同样品中的动力学结个循环中使用包括(i)抗半抗原抗体和抗分析物的捕获抗体或(ii)抗半抗原抗体和链霉亲和素任选地进一步浸渍在DMSO溶液中来再生半抗原许利用变性试剂来在每个循环之后在不降低所述固相上的半抗原的结合活性的情况下高效洗2(b)将所述探针尖端浸渍在包括与捕获抗体共价连接的抗半抗原抗体的双抗体溶液(d)将所述探针尖端浸渍到含有具有所述分析物的液体样品的样品容器中，持续第二(e)通过测量所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相移并且相对于校准曲线对所述相移进行定量来测定所述样品中(h)将步骤(b)到(g)重复3到15次，除了在每个循环的步骤(d)中使用包括新样品的容2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗半抗原抗体和所述捕获抗体两者均与分子3.一种测量各自包括样品抗体的多个样品中的样品抗体与样品抗原的结合动力学的(b)将所述探针尖端浸渍在包括与第一抗体共价连接的抗半抗原抗体的双抗体溶液(c)将所述探针尖端浸渍到含有所述样品抗体的抗体样品容器中，以使所述样品抗体使所述样品抗原与所述探针结合并测定第二干涉测(f)计算所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相(g)将所述探针尖端浸渍到包括第二水溶液的第二洗涤容器中，以测量第三干涉测量(h)计算所述第三干涉测量术图案与所述第二干涉测量术图案之间的干涉测量术相3(k)将步骤(b)到(i)重复3到15次，除了在每个循环的步骤(c)中使用包括新样品抗体4.根据权利要求3所述的方法，其中所述抗半抗原抗体和所述第一抗体两者均与分子8.根据权利要求1或3所述的方法，其中9.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述探针尖端(d)将所述探针尖端浸渍到含有具有生物素化分析物的液体样品的样品容器中，持续(e)通过测量所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术(f)将所述探针尖端浸渍在pH为1.0到4.0的酸性溶液中并且然后浸渍在DMSO溶液中，(h)将步骤(b)到(g)重复3到15次，除了在每个循环的步骤(d)中使用包括新样品的容(e)将所述探针尖端浸渍到包括结合对的第二成员的第二样品容器中，持续第二时间(f)计算所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相(g)将所述探针尖端浸渍到包括第二水溶液的第二洗涤容器中，以测量第三干涉测量4(h)计算所述第三干涉测量术图案与所述第二干涉测量术图案之间的干涉测量术相(k)将步骤(b)到(i)重复3到15次，除了在每个循环的步骤(e)中使用包括所述结合对14.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述链霉亲和素和所述抗半抗原抗体两者均与分子量为1,000道尔顿到500,000道尔5缀合物溶液，并且通过在每个反应循环完成之后将测试探针浸渍在pH为约1-4的酸性溶液[0002]如生物层干涉测量术(BLI)和表面等离子体共振(SPR)等无标记检测方法已经成为生物医学研究中的受体/配体结合研究以及治疗剂研发中的标准方法。在整个医疗保健施开销。[0004]用于再循环免疫试剂的任何方法通常集中于将免疫复合物与如酸性/碱性pH溶而不会不利地影响其结合性质以及因此测定[0010]图4展示了用于抗原定量的本发明的第一实施例，其中抗半抗原抗体与捕获抗体[0012]图6展示了用于定量生物素化分析物的本发明的第三实施例，其中抗半抗原抗体[0013]图7展示了用于结合对的结合动力学的本发明的第四实施例，其中抗半抗原抗体[0014]图8还展示了结合对的结合动力学的本发明的第四实施例，其中抗半抗原抗体与6[0017]图11示出了使用链霉亲和素包被的探针的生物素-抗His抗体以及His-IL2r的结[0019]权利要求书和说明书中使用的术语应根据本领域技术人员理解的通常含义来解[0030]本发明公开了一种用于在维持可接受测定性能的同时在用于定量或动力学的生7[0034]本发明的探针再生和再循环，同时在每个循环中将结合对的新鲜抗半抗原/成员[0035]本发明的第三特征是对结合对的第二成员与探针表面的结合的生物层干涉测量被的固相的稳定性允许利用多种变性试剂来高效可以包含允许检测多个波长中的每个波长的强[0041]波导106可以被配置成将由光源102发射的光传输到探针108，并且然后将由探针8涉层包含五氧化二钽(Ta2O5)层116和二氧化硅(SiO2)层118。五氧化二钽层116可以薄(例相位特性的偏移来监测沿探针108的远端形成的生物板具有在所述单片式基板的相对末端处基本上彼此平行布置的第一和第二表面；干涉层，分析物分子与分析物结合分子结合形成的生物层与含有样品的溶液之间的第二界面充当9层204的厚度为大约900nm-1,00针200远端的反射主要是由于分析物分子208而不是干涉层204与分析物结合分子206之间氟化锶(SrF23nm，而干涉层304的厚度可以为大约800nm-1,000nm。由分析物结合分子306和分析物分子可以基于由这两个反射表面反射的光束的干涉来估计。随着分析物分子208附接到分析物结合分子206(或从分析物结合分子分离)，第一反射表面与第二反射表面之间的距离将改形成的干涉图案根据由于结合事件引起的生物层厚度以绘制动力学结合曲线作为偏移量与时间的关系图。分析物分子与固定在干涉层204的远连接的抗半抗原抗体的双抗体溶液的双抗体容器中，其中所述捕获抗体是抗分析物的抗定所述探针尖端的基线干涉测量术图案；(d)将所述探针尖端浸渍到含有具有所述分析物的第二干涉测量术图案；(e)通过测量所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相移并且相对于校准曲线对所述相移进行定量来测定所述样品中的洗脱所述免疫复合物；(g)将所述探针尖端浸渍在包括pH为6.0到8.5的第二水溶液的第二征使得探针尖端易于洗涤并且由于洗涤溶液的体积较大而导致对洗涤溶液的污染可忽略[0063]在优选实施例中，所述抗半抗原抗体和所述捕获抗体两[0065]在所述方法的步骤(d)中，将所述探针尖端浸渍在含有具有分析物的液体样品的[0066]在步骤(e)中，通过测定所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相移并且相对于校准曲线对所述波长相移进行定量以测定分析物浓度来[0072]本发明的第二实施例测量各自包括样品抗体的多个样品中的样品抗体与样品抗p所述样品抗原的结合动力学；(g)将所述探针尖端浸渍到包括第二水溶液的第二洗涤容器p(k)将步骤(b)到(i)重复3到15次，除了在每个循环的步骤(c)中使用包括新样品抗体的抗[0074]每个步骤的细节与上文在第一实施例中描述的对应的相似步骤(如果有的话)的的缔合速率(结合)。步骤(g)通过将探针浸渍在不含有任何样品抗原的第二洗涤溶液中而入到生物分子中。有许多可商购获得的生物素类似物被设计用于与生物分子的伯胺和仲浸渍在包括与链霉亲和素共价连接的抗半抗原抗体的溶液中；(c)将所述探针尖端浸渍在测量所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图案之间的干涉测量术相移并且相对于校准曲线对所述相移进行定量来测定所述样品中的生物素化分析[0084](f)将所述探针尖端浸渍在pH为约1.0到4[0085]每个步骤的细节与上文在第一实施例中描述的对应的相似步骤(如果有的话)的在亲和力成熟程序中是最有用的，以通过在CDR区域中产生随机突变来进一步增强抗体亲接的抗半抗原抗体的溶液中；(c)将所述探针尖端浸渍到包括结合对的生物素化第一成员以测定所述探针尖端的基线干涉测量术图案；(e)将所述探针尖端浸渍到包括结合对的第并测定第二干涉测量术图案；(f)计算所述第二干涉测量术图案与所述基线干涉测量术图图案；(h)计算所述第三干涉测量术图案与所述第二干涉测量术图案之间的干涉测量术相浸渍在包括pH为约1.0到4.0的酸性溶液的洗脱容器中并且然后将所述探针尖端浸渍在在每个循环的步骤(e)中使用包括所述结合对的新的第二成员的样品容器以外，由此测定多个样品中的所述结合对的所述第一成员和所[0092]每个步骤的细节与上文在第一实施例或第三实施例中描述的对应的相似步骤(如最小化PCR样品管中的蒸发和随后的冷凝。诸位发明人已经证明探针尖端处的探针和免疫[0099]各种半抗原/抗半抗原对可以用于本发明。荧光素和洋地黄毒苷(digoxiginnen)如，荧光素-NHS酯(英杰公司(Invitrogen))或洋地黄毒苷-NHS酯(ATTBioquest)与BSA以15：1的摩尔偶联比在pH为7.4的PBS中反应1小时，随后在PD10柱(通用电气医疗集团(GE学气相沉积(CVD)机器中以包被厚度通常为1-2nm的氨丙基硅烷(A[0101]然后将探针尖端浸渍在荧光素-BSA或洋地黄毒苷-BSA(30μg/ml)于pH为7.4的PBS[0103]制备双抗体偶联物用于检测IgG的测定。如下制备抗半抗原和抗Fc的缀合物。使[0104]将2mg的抗半抗原-抗荧光素(杰克逊免疫研究公司(JacksonImmunoresearch))或抗洋地黄毒苷(赛默飞世尔公司)与2mg抗Fc(杰克逊免疫研究公司)混合并且与SMCC(赛[0105]将SMMC标记的抗体混合物与硫醇化的F[0111]图4图示了IgG(Fc)测定方案和通过含有IgG(Fc)样品和各种试剂的微孔的探针转另一个IgG样品进行测定序列。[0116]表2示出了遵循图4中描述的方案使用抗荧光素-抗人IgG(Fc)缀合物的人IgG测定[0121]图6图示了荧光素包被的探针通过含有抗荧光素-链霉亲[0126]表4示出了用同一荧光素包被的探针和抗荧光素-链霉亲和素结合试剂对10μg/ml