（正式版）DB31∕T 955-2022 《猪圆环病毒3型实时荧光PCR 检测方法》

猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法上海市市场监督管理局I 1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 1 5仪器设备 6耗材 2 28样品采集与处理 2 310实时荧光PCR检测 3附录A(规范性)溶液配制 5附录B(规范性)引物和探针 附录C(规范性)DNA提取方法 7附录D(规范性)荧光PCR反应体系 8本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件代替DB31/T955—2015《猪圆环病毒2a/2b亚型实时荧光PCR检测和分型方法》,与——增加了耗材(见第6章);——更改了试剂(见第7章，2015年版的第6章);——增加了粪便样品采集方法(见第8章);——删除了注意事项(见2015年版的第9章);——更改了附录A(见附录A,2015年版的第6章);——DB31/T955—2015。H1猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法本文件规定了猪圆环病毒3型实时荧光PCR检测方法的仪器设备、耗材、试剂、样品采集与处理、DNA提取和实时荧光PCR检测等技术要求。本文件适用于猪圆环病毒3型核酸检测。下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。猪圆环病毒3型porcinecircovirustype3;PCV3属于圆环病毒科圆环病毒属新发猪病毒性传染病病原，表现为猪皮炎与肾病综合征的临床病症。开放阅读框openreadingframe;ORF循环数阈值cyclethresholdvalue每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环数。5.2研钵或组织研磨器。5.3干热灭菌器。25.5水浴锅。5.14涡旋混匀器。6.11.5mL无菌离心管。6.3与可调移液器匹配的吸头。7.1除特别说明以外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验室用水应符合GB/T6682的要求。7.3DNAzol,商品化DNA抽提试剂，于2℃~8℃保存。7.575%乙醇，无水乙醇和灭菌去离子水配制，一18℃以下预冷。7.7引物和探针，其序列按照附录B合成。8样品采集与处理8.1采样工具8.1.1手术刀、剪子、镊子，经160℃干热灭菌2h。8.1.2研钵或组织研磨器，经160℃干热灭菌2h。8.1.3真空采血管。8.1.5无菌棉拭子。8.1.715ml,无菌离心管。38.2样品采集8.2.1血清样品：用真空采血管采集受检猪静脉血2mL,室温或者37℃倾斜放置自然凝集20min~8.2.2全血样品：用EDTA真空抗凝管采集受检猪静脉血2mL,吸取1mL全血置于1.5mL无菌离8.2.3拭子样品：用无菌棉拭子反复刮擦呼吸道黏膜5次～10次，蘸取分泌物后将棉拭子放入5mL无菌离心管中，加入2mLPBS,浸泡20min～30min,振荡30s,吸取不少于0.5mL上清液至新的1.5mL无菌离心管内备用。8.2.7细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次后，将细胞培养物置于1.5mL无菌离心管中，编号备用。依据8.1、8.2要求采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2℃~8℃下保存应不超过24h,—18℃及以下可以稳定保存3个月，-70℃及以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行8.4样品处理8.4.1血清、全血、拭子和精液样品无须进行前处理，直接用于核酸提取。8.4.3粪便样品：5000r/min离心10min,吸取1mL上清液至1.5mL,无菌离心管内备用。DNA提取方法按附录C执行。10实时荧光PCR检测10.1反应体系的配制在试剂配制区内进行。设实时荧光PCR反应管数为n,并宜按照n+1个反应进行配制，按照附录D配制每个反应的体系。配制反应液在冰盒中进行。注：n为待检样品数+阳性管数+阴性管数。将10.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀，按照每管20μL分装于0.2mlPCR光学反应管中，做好标识转移至核酸提取区。410.4上机检测10.4.1荧光通道设置在检测区进行。将10.3离心后的PCR管放入荧光PCR检测仪中，设置报告荧光为HEX,采用其他报告荧光时应按仪器说明设定对应通道；淬灭荧光设定为None,校准荧光设定为None。可根据不同品牌仪器说明等效设置参数。10.4.2循环条件设置与检测a)第一阶段，95℃预变性3min;10.5结果判定阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚超过正常阳性对照有典型S形扩增曲线，且Ct值≤30;阴性对照没有扩增曲线，且无Ct值或Ct值>35;两10.5.3结果判定PCV3核酸阳性。阴性判定：被检样品检测结果HEX通道无Ct值或Ct值>35,且无典型的告为PCV3核酸阴性。 溶液配制配制2×PCR酶预混液，使其热启动Taq酶终浓度为160U/mL,Tris-HCI(pH8.4)终浓度为6(规范性)名称序列PCV3-F1(上游引物)PCV3-R1(下游引物)PCV3-P1(探针)5'-HEX-TACGATAAACAACTGGACCCC7(规范性)DNA提取方法C.2取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行匀，2℃~8℃10000r/min离心10min。2℃~8℃10000r/min离心5min。8(规范性)荧光PCR反应体系荧光PCR反应体系见表D.1。1个检测反应的加入量猪圆环病毒3型实时荧光PC