CN114931633B 一种来源于预激活抗原提呈细胞的自身免疫疾病疫苗的制备方法及其应用 （苏州尔生生物医药有限公司）

桑田街218号生物医药产业园二期乐pulsedwithantigen-specific一种来源于预激活抗原提呈细胞的自身免本发明涉及一种来源于预激活抗原提呈细呈细胞细胞膜制备成纳米囊泡或细胞膜组分负疫苗负载广谱多样的癌细胞抗原的同时克服了23S1、将抗原提呈细胞与负载自身免疫疾病全或将预激活的抗原提呈细胞的细胞膜组分和含有自身免疫疾病抗原细胞的细胞膜组所述第一递送粒子或第二递送粒子分别独立地为纳米粒子或微所述自身免疫疾病全细胞抗原由以下步骤制备得到：将含有自身免疫4HCO348.权利要求7所述的自身免疫疾病疫苗在制备用于治疗或预防自身免疫疾病药物中的5能够诱导机体产生免疫耐受的疫苗是实现上述目的主要方法之一。由于β细胞主要是由效应性T细胞(Teff)攻击的，所以诱导能够和效应性T细胞识别相同抗原但是对效应性T细胞[0003]为解决上述技术问题，本发明提供了一种来源于被纳米粒子和/或微米粒子激活[0004]本发明提供了一种来源于预激活抗原提呈细胞的自身免[0007]或将预激活的抗原提呈细胞的细胞膜组分负载在负载自身免疫疾病全细胞抗原6时负载抗原提呈细胞的膜组分和含有自身免疫疾病抗原的细胞的膜组分(以下均以β细胞[0014](1)将一种或多种抗原提呈细胞与负载自身免疫疾病全细胞抗原的纳米粒子和/[0017](4)将步骤(2)和(3)得到的产物与负载自身免疫疾病全细胞抗原的第二递送粒子胞集落刺激因子(GM_CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M_CSF)、活化素(activins)、抑制素7[0040]进一步地，第一递送粒子或第二递送粒子的内部和/或表面负载有抑制免疫的物4HCO3[0044]本发明还提供一种上述自身免疫疾病疫苗在制备用于治疗或预防自身免疫疾病8[0051]进一步地，负载于纳米粒子或微米粒子表面的水溶性抗原和/或非水溶性抗原负载后为一层或多层，表面负载多层水溶性抗原和/或非水溶性抗原时，层与层之间为修饰原的细胞或组织的全细胞抗原的纳米粒子和/或微米粒子激活抗原提呈细胞，从而使抗原和/或与粒子共作用的方法处理制备成纳米疫苗或微米疫苗，所得纳米疫苗或微米疫苗负[0055](1)疫苗中可以将一种或多种抗原提呈细胞的组分与自身免疫疾病的抗原表位整9[0056](2)纳米疫苗或微米疫苗中可以含有包括DC细胞在内一种或多种抗原提呈细胞的[0057](3)使用负载含有自身免疫疾病抗原的细胞和/或组织的全细胞抗原的纳米粒子米疫苗可以负载用于激活抗原提呈细胞的纳米粒和/或微米粒子所负载的全部抗原表位，[0059](5)将具有细胞活性的抗原提呈细胞处理后制备成无任何细胞活性的纳米疫苗或[0060](6)本发明在将抗原提呈细胞的膜组分包裹于递送粒子上的基础上，还将含有自[0061]上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚制备纳米粒子或微米粒子的示意图；b为采用含有溶解剂的溶解液溶裂解和溶解含有自身免疫疾病抗原的细胞或组织的细胞全细胞抗原并制备纳米粒子或微米粒子的示意图；c为[0064]图2_15分别为实施例1_14中用纳米疫苗或微米疫苗预防或治疗I型糖尿病等自身[0066]本发明所述的用于预防或治疗I型糖尿病等自身免疫疾病的纳米疫苗或微米疫微米粒子激活的抗原提呈细胞制备所得的纳米疫苗或微米疫苗。纳米粒子和/或微米粒子[0067]在制备用于激活抗原提呈细胞的负载含有自身免疫疾病抗原的细胞和/或肿瘤组[0068]在使用纳米粒子或微米粒子体外激活抗原提呈细胞时，可以使用细胞因子和/或备是也可以采用其他可以将活的抗原提呈细胞制备成不具有细胞活性的纳米疫苗或微米[0070]在一些实施方案中，采用负载含有自身免疫疾病抗原的细胞和/或组织全细胞抗原的纳米粒子或微米粒子激活的抗原提呈细胞后将抗原提呈细胞制备成纳米疫苗或微米[0071]步骤1，将第一预定体积的含有第一预定浓度的水相溶液加入第二预定体积的含裂解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原或是溶于尿素或盐酸胍等溶解剂中的原非定浓度要求蛋白质多肽浓度含量大于1ng/mL，能负载足够细胞全细胞抗原以激活相关细解物中的各组分在制备时分别为水溶性抗原或者是溶于尿素或盐酸胍等溶解剂中的原非免疫抑制剂在初始水相中的浓度为大于0.01ng[0074]在一些实施例中，制备粒子原材料为聚乳酸一羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚乳酸[0076]实际中，有机相的第二预定体积根据其和水相的第一预在本发明中，水相的第一预定体积和有机相的第二预定体积之比的范围为1:1.1_1:5000，体积与第二预定体积之比进行调整以调整制备的纳米粒或切均质机时转速大于100rpm，比如1000rpm～5000rpm；使用微流控处理流速大于0.01mL/min,比如0.1mL/min_100mL/min。超声或者搅拌或者均质处理或者微流控处理进行纳米化和/或微米化，超声时间长短或搅拌速度或均质处理压力及时间能控制制备的微纳粒子大剂的水溶液中并进行大于2秒的超声处理或大于1分钟的搅拌或进行均质处理或微流控处在本发明中，超声时间大于0.1秒，比如2～200秒，搅拌速度大于50rpm，比如50rpm~处理时使用高压/超高压均质机或高剪切均质机，使用高压/超高压均质机时压力大于20psi，比如20psi～100psi，使用高剪切均质机时转速大于1000rpm，比如1000rpm~施过程中为了控制纳米粒子或微米粒子的尺寸可以对第三预定体积和第四预定体积之比[0086]在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于第六预定体积的PBS(或生理盐水)中时不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面吸附癌细胞裂解物的[0087]在本发明一些实施方案中，步骤5所得沉淀重新混悬于含有冻干保护剂的水溶液[0091]步骤7，将第六预定体积的步骤5中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第六预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤6得到的冷冻干燥后的含有含有组织裂解物中的水溶性抗原或者溶解的原非水溶性抗原的体积与为1mL。在实际使用[0094]步骤8，将抗原提呈细胞与上述制备的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一定时制备纳米粒子和/微米粒子的组织和/或细胞与抗原提呈细胞可以来自于自体或者同种异[0096]步骤10，将机械处理后的抗原提呈细胞和/或含有自身抗原的细胞样品进行梯度的含有细胞全细胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原的溶液中，或者将剩下的沉淀物重新混悬于第五预定体积的第五预定浓度的含有细胞全细胞抗原中水溶性和/或非水溶性抗原或矿化处理试剂,作用一定时间后离心洗涤，然后加入第七预定提交的含有带正电或者带[0101]在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于第七预定体积的带电物质后可不需要冻干，可直接进行后续纳米粒子或微米粒子表面负载细胞/组织裂解物的相关[0102]在本发明一些实施方案中，步骤6所得沉淀重新混悬于含有干燥保护剂的水溶液[0105]步骤8，将第八预定体积的步骤6中得到的重悬于PBS(或生理盐水)中的含纳米粒的混悬液或者采用第八预定体积的PBS(或生理盐水)重悬步骤7得到的干燥后的含有纳米非水溶性抗原混合后使用。[0106]在本发明中，步骤5_步骤8的修饰和抗原负载步骤可重复多次以提高抗原的负载含有组织裂解物中的水溶性抗原或者原非水溶性抗原的体积与为0.1_100mL。在实际使用[0108]步骤9，将抗原提呈细胞与上述制备的纳米粒子和/或微米粒子共孵育一定时制备纳米粒子和/微米粒子的组织和/或细胞与抗原提呈细胞可以来自于自体或者同种异[0110]步骤11，将机械处理后的抗原提呈细胞和/或含有自身抗原的细胞样品进行梯度材料，以雷帕霉素为免疫抑制剂采用溶剂挥发法制备负载有β细胞的水溶性组分和非水溶钠)溶解沉淀部分即可将NIT_1β细胞中不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h，在使用前将20mg冻干的纳米粒子重悬于[0120]将负载来源于β细胞全细胞抗原的纳米粒子(500μg，其中负载水溶性组分的纳米粒子250μg，负载非水溶性组分的纳米粒子250μg)或空白纳米粒(500μg)+游离裂解液与7000g离心20分钟后收集上清液后使用0.22μm的滤膜过滤挤出后收集滤液，100μLPBS，连续给6周。各组小鼠从第8周开始每天记录小鼠血糖情况。以血糖高于的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米疫苗1处理的小鼠，在25周后只有约40％小鼠提呈细胞制备的纳米疫苗对I型糖尿病具有良好预防效果，且预防效果优于纳米粒子激活述所得来源于细胞裂解物的水溶性组分和溶解于脱氧胆酸钠中的原非水溶性组分按质量料PLGA分子量为24KDa_38KDa，所采用的免疫抑制剂为雷帕霉素和他克莫司混合免疫抑制PLGA微米疫苗约负载90μg蛋白质或多肽组分，每1mgPLGA微米疫苗所负载的雷帕霉素和他同，负载等量雷帕霉素和他克莫司但是不负载任何裂解后的水溶性组分和非水溶性组分。剂。[0137]将负载全细胞抗原的微米粒子(500μg)或多肽微米粒子(500μg)或空白微米粒(500μg)+游离裂解液与BMDC(500万个)和B细胞(500万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有GM_CSF(2000U/mL)、IL_2(200U/mL)、IL_7[0139]通过在400g离心5分钟收集孵育后的抗原提呈细胞，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(20W)超CD4抗体、CD25抗体、Ly49抗体和FOXP3抗体，尔后流式细胞术分析T细胞亚群中CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T细胞的比例和CD8+Ly49+T占CD8+T细胞的比例。微米粒子所负载的β细胞全细胞抗原在被抗原提呈细胞B细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别β细胞全细胞抗原的特异性T细胞即可以识别β细胞全细胞抗原表位后被激活并高表达特异性表面标志物。使用流式细胞术分析的高表达特定标志物的T细胞即为调呈细胞制备的纳米疫苗处理的小鼠在25周后有50％患有糖尿病。在采用负载β细胞全细胞抗原的微米粒子激活的抗原提呈细胞制备的微米疫苗处理的小鼠在25周后只有约30％小CD8+Ly49+T细胞和CD4+CD25+FOXP3+T细胞分别占CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例明显高于负载多肽的微米粒子和空白微米粒子+游离裂解液激活的DC+B细胞制备的纳米疫苗所诱导的米疫苗可以更好的激活具有识别和抑制Teff的β细胞特异性[0148]本实施例以小鼠胰岛组织裂解物全细胞组分和β细胞裂解物全细胞组分混合物制[0150]处死小鼠后收集小鼠胰岛组织，将胰岛组织通过细胞过滤网后制备成单细胞悬[0151]在高糖DMEM完全培养基(葡萄糖含量为正常含量的4倍)中培养NIT_1细胞24小的水溶性组分。将沉淀部分使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)溶解即为溶解剂溶解后的非水溶性组分。高葡萄糖条件和使用毒胡萝卜素[0152]上述来源于β细胞裂解物的水溶性组分和来源于胰岛组织裂解物的水溶性组分按岛组织裂解物的非水溶性组分按质量比1:1混合后即为非水溶性组分混合物；将水溶性组前将其用9mLPBS重悬然后加入1mL的裂解液组分(蛋白质浓度80mg/mL)并室温作用10min，得到内外都负载全细胞裂解物组分的微米粒子系统。所得微米粒子平均粒径为2.55μm左[0156]本实施例使用来源于外周血的DC细胞以及B细胞作为抗原提呈细胞。处死小鼠后从小鼠PBMC中分选出CD19+B细胞和CD11c+DC,将上述B细胞和DC按数量比1:1混合即为所用中含500万个DC和500万个B细胞)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃,5%CO2)，孵育体系中含有细胞因子组合1:TGF_β(2000U/mL)、IL_4(200U/mL)、IL_7(1000U/[0159]或者将负载全细胞抗原的微米粒子(500μg)与混合抗原提呈细胞(共1000万个细5％CO2)，孵育体系中含有细胞因子组合2:TNF_a(2000U/mL)、IL_12(200U/mL)、IL_6在15mL高糖DMEM完全培养基中孵育72小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有细胞因子组合[0162]通过在300g离心4分钟收集步骤(4)激活后的混合抗原提呈细胞(1000万个，其中淀收集上清液，将上清液与滤液与步骤(2)制备的微米粒子(80mg)混合后在20W超声处理3合抗原提呈细胞共孵育过程中加入细胞因子组合1所激活的混合抗原提呈细胞所制备的微细胞因子组合2所激活的混合抗原提呈细胞所制备的微米疫苗为微米疫苗2，粒径酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在低功率粒子(80mg)混合后在20W超声处理3分钟后共孵育15分钟后使用5μm的滤膜过滤挤出后收集+250万个B细胞)和NIT_1细胞(500万个)并混合，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐理3分钟后共孵育15分钟后使用5μm的滤膜过滤挤出后收集滤液，然后将滤液在8000g离心和FOXP3抗体，尔后流式细胞术分析T细胞亚群中CD4+细胞吞噬后可被降解成抗原表位被提呈到抗原提呈细胞表面，可以识别β细胞全细胞抗原苗3处理组小鼠在25周后有约30％小鼠患有I型糖尿病；微米疫苗1处理组小鼠在25周后有粒子激活的混合抗原提呈细胞细胞膜组分，可以明显提高疫苗预防I型糖尿病的功效；而且，粒子表面负载有含有I型糖尿病相关抗原的细胞的细胞膜组分也可以提高微米疫苗预的细胞膜组分时预防I型糖尿病的效果最佳。微米疫苗1明显优于微米疫苗3说明在将抗原提呈细胞细胞膜组分负载在粒子表面前将抗原提呈细胞使用负载细胞全细胞抗原的粒子粒子激活混合抗原提呈细胞时加入特定细胞因子有助于提高抗原提呈细胞细胞膜所制备reg[0171]如图4b和4c所示，微米疫苗1所能诱导的自身抗原特异性T多于微米疫苗2和微regregreg[0173]本实施例使用了高葡萄糖条件和使用毒胡萝卜素增加含有与自身免疫疾病抗原[0175]本实施例以小鼠I型糖尿病模型来说明如何使用抗原提呈细胞来源的纳米疫苗预例中采用了硅化和添加带电物质的方法来增加抗原的负载量，且只进行了一轮矿化处理。培养基中孵育30min,然后通过细胞过滤网制备单细胞悬液，并加入适量纯水并反复冻融5上清液即为可溶于纯水的水溶性抗原；在所得沉淀部分中加入10％的十二烷基硫酸钠(SDS)水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的非水溶性抗原转化为在10％SDS水溶液中10000g离心20分钟，然后使用7mLPBS重悬纳米粒子并与3mL含有细胞裂解物(60mg/mL)的纯水离心洗涤后使用3mL含鱼精蛋白(5mg/mL)和聚赖氨酸(10mg/mL)的PBS重悬并作用10min,然后10000g离心20min洗涤，采用10mL含有裂解物(50mg/mL)的PBS溶液重悬并作用粒子使用前将其用7mLPBS重悬然后加入3mL的裂解液组分(蛋白质浓度50mg/mL)并室温作[0180]对照多肽纳米粒子的制备材料和制备方法相同，负载四种质量等量的β细胞多肽为InsulinB9_23,InsulinA14_20,IGRP2吹打，使细胞团块分散，然后使用70μm细胞滤器将细胞过筛，转移至15mL离心管内，弃上清用冷的配置好的骨髓巨噬细胞诱导培养基(含有15％L929培养基的DMEM高糖培养[0187]将负载全细胞抗原的纳米粒子(500μg)或多肽纳米粒(500μg)或空白纳米粒(500μg)+游离裂解液与制备的DC(500万个)和BMDM细胞(500万个)在15mLRPMI1640完全培养基中共孵育24小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM_[0189]通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC和BMDM，然后使用含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细[0193]如图5所示，PBS或者空白微米粒+细胞裂解物激活的抗原提呈细胞制备的纳米疫胞抗原的纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米疫苗处理的小鼠在25周后只有约30%公藤为免疫抑制剂制备负载有β细胞全细胞抗原的纳米粒子。使用纳米粒子激活抗原提呈[0199]本实施例中纳米粒子采用复乳法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLA分子量为[0203]将负载全细胞抗原的微米粒子(500μg)与BMDC(1000万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有TGF_β(1000U/mL)、IL_10(2000U/[0205]通过在400g离心5分钟收集孵育后的BMDC(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃使用超声(20W)处理1分钟，然后使用高压均质机(工作压力5MPa)均质处理1分钟。然后将样品在1000g离心15分钟并收集上清液，然后在6000g离心15分钟后弃去沉淀，收集上清液后在16000g离心90分钟后弃去上清液并收集沉淀，将沉淀重悬后与步骤(2)制备的负载全细胞抗原的纳米粒子(50mg)混合后在10W超声30秒后共孵育15分钟后使用0.45μm的滤膜过滤挤[0206]通过在400g离心5分钟收集孵育后的BMDC(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃使用超声(20W)处理1分钟，然后使用高压均质机(工作压力5MPa)均质处理1分钟。然后将样品在1000g离心15分钟并收集上清液，然后在6000g离心15分钟后弃去沉淀，收集上清液后在16000g离心90分钟后弃去上清液并收集沉淀，将沉淀使用PBS重悬后即可得只含有被激活苗1处理的小鼠在25周后有20％患有糖尿病。这说明纳米疫苗1优于纳米疫苗2和纳米疫苗3，内部负载癌细胞全细胞抗原和表面负载被激活抗原提呈细胞的细胞膜组分都有利于提2表面都负载有MHC分子与抗原多肽结合后的复合物。具有膜结构的纳米疫苗1既可以直接将NaiveT细胞诱导成具有负向调节功能的调节性T细胞(Treg)，也可以被抗原提呈细胞吞regreg用纳米粒子激活抗原提呈细胞后利用抗原提呈细胞制备纳米疫苗用于预防自身免疫疾病_[0216]本实施例中纳米粒子采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLA分子纳米粒子负载四种等质量的抗原多肽(InsulinB9_23,InsulinA14_20,IGRP206_214,从淋巴结细胞单细胞悬液中分选出CD11c+DC和CD19+[0220]将负载全细胞抗原的纳米粒子(500μg)或多肽纳米粒(500μg)与DC(500万个)和B细胞抗原的纳米粒子(500μg)与DC(1000万个)在20mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小时[0222]通过在400g离心5分钟收集孵育后的DC(500万个)和B细胞(500万个)或者只收集DC细胞(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两得上清液与步骤(2)所制备的相对应的激活抗原提呈细胞的纳米粒子(20mg)混合后在[0226]如图7所示，PBS或者空白微米粒+细胞裂解物激活的抗原提呈细胞制备的纳米疫苗处理的小鼠在25周后有70％_80％患有I型糖尿病；纳米疫苗预防处理的小鼠患有I型糖粒子激活的DC和B细胞混合制备的纳米疫苗效果优于负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子激好。这可能是因为激活的B细胞内的一部分组分包含进抗原提呈细胞制备的纳米疫苗后可[0228]本实施例以I型糖尿病为模型来说明如何使用被纳米粒子激活的抗原提呈细胞制即为可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入含有8M尿素和2％精氨酸的水溶液分和非水溶性组分按质量比1:1混合即为制备纳米粒子的原[0232]本实施例中纳米粒采用溶剂挥发法制备。所采用的纳米粒子制备材料PLA分子量为20KDa，所采用的免疫抑制剂为雷帕霉素和胍立莫司，且免疫抑制剂分布于纳米粒子内用10mL含4％海藻糖的超纯水重悬后冷冻干燥48h。使用前将20mg纳米粒重悬于0.9mLPBS粒子平均粒径为280nm左右，纳米粒子表面电位为_3mV左右；每1mgPLGA纳米粒子约负载用流式细胞术从PBMC中分选出CD11c+DC。本实施例中同时使用DC和BMDM作为抗原提呈细[0236]将负载细胞全细胞抗原的纳米粒子(1000μg)与外周血来源的DC(500万个)和BMDM(500万个)在20mLRPMI1640完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，或者将负载癌细胞全细胞抗原的纳米粒子(500μg)与外周血来源的DC(1000万个)在RPMI1640完全培养基中[0238]通过在400g离心5分钟收集孵育后的外周血来源的DC(500万个)及BMDM(500万个)或者只收集外周血来源的DC(1000万个)，然后使用含有蛋白酶抑制剂的4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在高压均质机中(5000bar)中处理5分钟。然后将样品在2000g离心15分钟并收集上清液，将上清液在8000g离心15分钟后收集上清的DC制备的纳米疫苗，说明多种被纳米粒子激活的抗原提呈细胞制备的纳米疫苗效果更[0244]本实施例以I型糖尿病为模型来说明如何使用负载β细胞全细胞抗原的纳米粒子[0246]收集培养的NIT_1细胞，将NIT_1细胞使用8M尿素水溶液(含500mM氯化钠)中裂解后用8M尿素水溶液溶解裂解物组分即为制燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为360nm左右，纳米粒子表面电位为_5mV左右；每1mg[0253]将负载全细胞抗原的纳米粒子(800μg)或者空白纳米粒子(800μg)+等量游离裂解液与外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48[0255]通过在400g离心5分钟收集孵育后的外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万实施例1中步骤2所制备的相应的纳米粒子(50mg)以及DSPE_PEG_CD32单抗在10W超声处理22所制备的相应的纳米粒子(50mg)在10W超声处理2分钟后使用0.45μm的滤膜过滤挤出后收[0261]本实施例以小鼠胰腺组织来说明如何制备负载有β细胞的胰腺组织全细胞抗原的于3000RPM的转速离心5min取上清液即为组织细胞中可溶于纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素水溶液溶解沉淀部分即可将不溶于纯水的原非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。将水溶性组分和溶解于8M尿素中的原非水溶性组分按照质量比1:1TGF_β的mRNA和雷帕霉素分布于微米粒子内部，在制备时mRNA溶解于水相中而雷帕霉素溶解于有机相中。制备方法如前所述，微米粒子平均粒径为1.5μm左右，表面电位Zeta[0269]将负载细胞全细胞抗原的微米粒子(1000μg)或空白微米粒子(1000μg)与BMDC(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)；或者将负载全细胞抗原的微米粒子(1000μg)与B细胞(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育72小4℃磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗涤细胞两遍，将细胞重悬在PBS水中后在4℃低功率(10W)超声[0277]本实施例以I型糖尿病为模型来说明如何使用负载β细胞全细胞抗原的纳米粒子水溶性组分按质量比1:1混合即为制备对照纳米粒子的[0280]在高糖培养基中将葡萄糖含量增加一倍，并同时加入0.05μM/L毒胡萝卜素(Thapsigargin)至培养基中孵育培养NIT_1细胞12小时。增加葡萄糖的含量或添加毒胡萝纯水的水溶性组分；在所得沉淀部分中加入8M尿素(含500mM氯化钠)水溶液溶解沉淀部分即可将NIT_1细胞中不溶于纯水的非水溶性组分转化为在8M尿素水溶液中可溶。将上述水溶性组分和非水溶性组分按质量比1:1混合即为制备激活抗原提呈细胞的纳米粒子的抗原水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为260nm左右，纳米粒子表面电位为_[0286]将负载全细胞抗原的纳米粒子(800μg)与外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有IL_13[0288]通过在400g离心5分钟收集孵育后的外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万(30mg)以及DSPE_PEG_CD32单抗(30μg)在1200RPM搅拌处理2分钟后使用0.45μm的滤膜过滤添加化学物质处理的β细胞制备的纳米粒激活的抗原提呈细胞所制备的纳米疫苗效果好于裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取上清液即为NIT_1细胞可溶于纯水的水溶性溶性组分按质量比1:1混合即为制备对照纳米粒子的水重悬后冷冻干燥48h后备用。该纳米粒子平均粒径为250nm左右，纳米粒子表面电位为_[0301]将负载全细胞抗原的纳米粒子(800μg)与外周血来源的DC(1000万个)和BMDC(1000万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有胞抗原的纳米粒子(800μg)与外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万个)在15mL高糖DMEM抑制剂和蛋白酶抑制剂的存在下超声机械破坏抗原提呈细胞。经过离心后所获细胞膜用抗原提呈细胞过程中加入细胞因子或抗体激活的抗原提呈细胞所制备的纳米疫苗效果好于在纳米粒激活的抗原提呈细胞过程中未加入任何细胞因子或抗体的抗原提呈细胞制备呈细胞激活过程中细胞因子和/或抗体的添加有助于提高被激活的抗原提呈细胞制备的纳裂解物以大于100g的转速离心1分钟以上并取上清液即为NIT_1细胞可溶于纯水的水溶性溶性组分按质量比1:1混合即为制备对照纳米粒子的料PLGA分子量为24KDa_38KDa，所采用的抑制剂为雷帕霉素和白介素2，使用KALA多肽[0316]将负载全细胞抗原的纳米粒子(800μg)与外周血来源的DC(800万个)和BMDC(800万个)在15mL高糖DMEM完全培养基中共孵育48小时(37℃,5％CO2)，孵育体系中含有IL_13抑制剂和蛋白酶抑制剂的存在下超声机械破坏抗原提呈细胞。经过离心后所获细胞膜用纳米粒激活的抗原提呈细胞所制备的纳米疫苗效果好于未负