SN∕T 4853.6-2017 转基因大米定量检测数字PCR法 第6部分：T2A-1品系

SN/T4853.6—2017Part6:EventT2A-12017-07-21发布2018-03-01实施I 1SN/T4853.6—2017本标准规定了稻谷和大米中T2A-1品系的数字PCR定量检测方法。本标准适用于稻谷和大米中T2A-1品系特异性的数字PCR定量检测。本方法的定量检测低限(LOQ)为0.1%(质量分数)。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法SN/T1194植物及其产品转基因成分检测抽样和制样方法下列术语和定义适用于本文件3.1.1SPS基因Thegeneofsucrosephosphatesynthase蔗糖磷酸合成酶基因，大米单拷贝内参照基因。3.1.2外源DNA插入受体大米基因组后经重组产生的邻接区序列。具体序列参见附录A。3.1.3Taq酶TagDNApolymerase源于水生栖热菌的耐热DNA聚合酶。3.1.4模板template数字PCR引物/探针扩增检测的特定DNA片段。3.1.5定量检测低限limitofquantification;LOQ在相对标准差不超过25%的条件下，检测方法所能定量的最低转基因成分百分含量。2NC:阴性对照(negaitivecontrol)3扩增基因名称序列(5'-3′)PCR扩增片段长度SPS基因上游引物GAGGTCACCAAGGCTGCCAGTG下游引物GCACTCCTGATTCTTCCAGGCTTC探针VIC-TAGGCTTCCCAGCAGGCAACCAA-BHQ1T2A-1转化体特异性序列上游引物AAAGCTAGCCTCGTTTATTCCT93bp下游引物CTAGCGTTCGTACAGTTTAAGCT探针FAM-CAACGAATCTTCCTGTCTGCCTGCT-BHQ1注1:表中PCR体系中引物/探针的终浓度可根据每合成批次的验证结果进行适当调整。注2:荧光探针的发光基团应与数字PCR仪的荧光通道匹配，通常用5'-FAM/3'-BHQ1或5'-VIC/3'-BHQ1方式标记。10μmol/L后分装，-20℃避光保存。SN/T4853.6—201748实验步骤按照GB/T19495.7的规定执行。8.2样品制备除另有规定外，样品制备按照GB/T19495.7或SN/T1194的规定执行。将样品适度破碎、均一化，取出至少200g,全部放入样品研磨机中，研磨至60目左右粒度。破碎和研磨过程中应调整设备的操作参数，避免过热并防止样品粘连。8.3.1核酸提取及PCR抑制物的判断除另有规定外，DNA提取纯化及PCR抑制物的判断按照GB/T19495.3中的规定执行。称取2份(每份2g)研磨后样品作为测试样，分别提取基因组DNA。采用PicoGreendsDNA荧光定量试剂盒或其他具有等效结果的仪器/方法测定DNA溶液的浓度，具体操作步骤参照相关仪器/试剂盒说明书数字PCR体系中的模板数应不高于微反应体系数的5倍。为保证定量结果的准确性，体系中总模板数应不低于400个拷贝。将样品DNA溶液作适度稀释，选择模板浓度在100拷贝/μL～20000拷贝/μL范围内的稀释液分别用于SPS基因拷贝数和转化体特异性序列拷贝数的数字PCR定量检测。8.4数字PCR扩增8.4.1数字PCR体系配制按表2将各组分加入洁净离心管中，充分混匀。试剂dH2O(无菌水)外源基因反应体系SN/T4853.6—20175表2(续)T2A-1荧光标记探针溶液(10pμmol/L)dH₉O(无菌水)注：数字PCR反应体系的总体积可根据不同厂家、型号的数字PCR仪作8.4.2微反应体系生成、数字PCR扩增及结果读取作说明生成微反应体系。将微反应体系放置于PCR扩增仪中，按以下参数进行PCR扩增：95℃,9检测质量控制9.1对照设置9.2检测结果有效性判定以下结果中若有一项不符合，则样品检测结果无效，应查找原因并重做试验：a)NC和NTC的T2A-1转化体特异性检测无阳性扩增；b)PC的SPS基因或T2A-1转化体特异性序列检测有阳性扩增；c)PC的定量结果与已知值相符。10结果计算10.1数字PCR仪运行后经软件计算得出每个测试样的SPS基因拷贝数和T2A-1转化体特异性序列拷贝数，取3个平行试验的均值，按照式(1)计算测试样的转基因成分含量：…………SN/T4853.6—20176A——转基因大米品系T2A-1的含量(%);B——T2A-1转化体特异性序列拷贝数；C——水稻内标准基因SPS拷贝数；10.2如两个测试样的T2A-1品系含量的相对相差大于或等于35%,则测试结果应放弃，并应重做样品制备及后续试验。相对相差的计算参照GB/T19495.5中的规定执行。10.3如两个测试样的T2A-1品系含量的相对相差小于35%,则样品的定量检测结果等于两个测试样转基因大米品系T2A-1成分含量的平均值。定量检测结果有四种情况，每种检测结果的表述如表3所示。未检出SPS基因的LOQ(0.1%)SN/T4853.6—2017