Zoono Limited 测试物质对猫杯状病毒的悬浮时间杀灭法抗病毒活性及功效

ZoonoLimited测试物质对猫杯状病毒的悬浮时间杀灭法抗病毒活性及功效研究标题：

ZoonoLimited测试物质对猫杯状病毒的悬浮时间杀灭法抗病毒活性及功效测试方法：ASTM国际标准测试方法E1052评估抗菌剂对悬浮液中病毒的作用研究编号：NG11178研究赞助方：LewMacKinnonZoonoLimited31HanniganDriveSt.Johns,Auckland1072Auckland,NewZealand+6427-652-5299lew.mackinnon@测试机构：MicrochemLaboratory1304W.IndustrialBlvdRoundRock,TX78681(512)310-8378

ASTME1052：一般信息ASTMInternational（美国材料与试验协会（ASTM）的前身）是一个国际公认的组织，负责制定和发布产品及测试标准。ASTME1052测试方法用于确定液体产品（如洗手液、非处方外用制剂及其他护肤产品）的杀病毒效果。该方法也适用于对设计用于硬质无孔表面的液体抗菌产品进行初步评估。在ASTME1052测试中，病毒悬浮液以1:10的比例（1份病毒悬浮液+9份制备好的测试产品）暴露于测试产品。同时，以相同方式处理对照悬浮液，但使用细胞培养基代替测试产品。中和后，使用标准细胞培养（例如TCID₅₀）或噬斑测定技术对悬浮液进行计数。计算Log₁₀和百分比减少值，以确定测试产品悬浮液相对于对照悬浮液的有效性。ASTME1052相关的实验室资质MicrochemLaboratory在执行ASTME1052测试方法方面拥有丰富经验。该实验室已进行多次ASTME1052测试，以评估多种消毒剂和抗菌产品的杀病毒功效。此外，实验室还具备根据需要修改方法以满足客户需求的经验。在MicrochemLaboratory，每项ASTME1052测试均以适合研究赞助方提交的测试物质的方式进行，同时保持研究的完整性。

研究时间表：测试和对照悬浮液制备悬浮液中和测定启动测定评分/计数报告交付2018年9月6日2018年9月6日2018年9月6日2018年9月10日2018年9月13日

测试物质信息：

测试物质于2018年8月8日收到，并拍摄了以下图片。收到的测试物质：Z-71MicrobeShield测试物质到货时即可用于研究。测试物质在研究过程中未进行稀释。

测试微生物信息：本次试验选用的测试微生物：

猫杯状病毒（Felinecalicivirus,FCV），ATCCVR-782

该病毒是一种无包膜、正链RNA病毒，属于水疱病毒属（Vesivirus），是猫呼吸道感染的常见原因。猫感染症状包括鼻分泌物和口腔溃疡。作为杯状病毒科（Caliciviridae）的成员，FCV与人类诺如病毒（humannoroviruses）密切相关，后者会引起以恶心、呕吐和腹泻为特征的急性胃肠炎。然而，与人类诺如病毒不同，FCV可使用简单的细胞培养测定系统。因此，猫杯状病毒是美国EPA批准的用于人类诺如病毒标签声明的替代微生物。FCV和人类诺如病毒均能在环境表面长时间保持活性，并对多种消毒剂活性成分具有抵抗力。

为FCV选择的允许宿主细胞系：CRFK（Crandell-Rees猫肾细胞），ATCCCCL-94

程序示意图：实验室接收的测试物质接种的测试物质和对照物质，评估初始接种物病毒滴度接触时间后中和测试悬浮液和对照悬浮液启动并完成检测孵育计算Log减少量和百分比减少量

程序总结：

1.解冻储备病毒，并根据要求补充有机干扰物（有机载量）。

2.将测试和对照物质以9份等量体积分装到无菌容器中。

3.分别向测试和对照物质中接种1份等量体积的测试病毒。

4.将测试悬浮液保持研究赞助方指定的接触时间，然后通过十倍系列稀释到适当溶液中进行中和。必要时使用凝胶过滤进行中和。

5.对照悬浮液以与测试悬浮液相同的方式进行中和。

6.中和后，使用标准细胞培养（例如TCID₅₀）或噬斑测定技术对病毒悬浮液进行定量，以确定感染性病毒的水平。

7.将测定托盘/板在最适合病毒-宿主细胞系统的时间（例如7天）内进行孵育。

8.孵育期结束后，对测定结果进行评分，以确定测试病毒的存在/缺失及细胞毒性效应。进行适当计算（例如Spearman-Karber法），以确定病毒滴度和测试物质细胞毒性水平（如适用）。

9.相对于对照悬浮液，计算测试悬浮液的Log₁₀减少量和百分比减少量，并报告给研究发起方。

ASTME1052研究的科学合理性标准：

MicrochemLaboratory认为悬浮液时间杀灭研究具有科学合理性，必须满足以下标准：1.从病毒对照悬浮液中回收至少6.00Log₁₀感染性病毒。

2.病毒细胞病变效应可与测试物质暴露引起的细胞毒性效应区分。

3.证明中和方法的有效性（稀释和/或凝胶过滤）。

4.指定为无菌对照的检测孔无感染性、污染和细胞毒性。

通过标准：

ASTM已定义病毒悬浮液时间杀灭测试的通过标准为：

1.在存在或不存在细胞毒性的情况下，相对于病毒对照，观察到病毒滴度减少≥3.00Log₁₀，超过细胞毒性水平。

本研究中使用的测试参数：测试物质浓度：N/A测试物质体积：0.900mL测试物质稀释液：N/A重复次数：两次对照物质：2%FBSEMEM对照物质体积：0.900mL中和方法：10%FBSEMEM和Sephacryl柱病毒接种物体积：0.100mL目标接种物：8.0Log₁₀/0.100mL接触时间：10分钟，24小时接触条件：环境温度宿主细胞系：CRFKATCCCCL-94细胞传代数：201检测培养基：2%FBSEMEM有机干扰物：N/A孵育期：见注释孵育条件：37±2°C，5.0±1.0%CO2

研究修改：本研究未对方法进行进一步修改。

研究注释：24小时接触时间于2018年9月6日14:35启动。24小时接触时间细胞培养检测的孵育于2018年9月7日启动，并于2018年9月10日完成（3天孵育期）。10分钟接触时间于2018年9月6日15:20启动。10分钟接触时间细胞培养检测的孵育于2018年9月6日启动，并于2018年9月10日完成（4天孵育期）。

对照结果：无菌性：已确认病毒对照滴度：见结果细胞毒性滴度：≤2.50Log₁₀每mL中和：已验证

计算：

1.使用Spearman-Kärber方法计算回收对照滴度（TCID₅₀）、测试物质暴露后的病毒滴度（TCLD₅₀）以及测试物质暴露后表现出细胞毒性的宿主细胞培养物滴度（TCD₅₀）。2.TCID₅₀（组织培养感染剂量）代表终点稀释度，其中50%的细胞培养物因测试病毒感染而表现出细胞病变效应。在给定暴露时间后杀死50%测试病毒所需的剂量称为组织培养致死剂量（TCLD₅₀），而50%宿主细胞单层表现出细胞毒性的终点稀释度称为组织培养剂量（TCD₅₀）。根据Spearman-Kärber方法确定TCID₅₀、TCLD₅₀和TCD₅₀，如下所示：TCID₅₀终点滴度的负对数=[–首次接种稀释度的对数]–[(每个稀释度死亡率百分比之和/100)–0.5)x稀释度的对数]此计算的结果表示为TCID₅₀/0.1ml（或接种稀释体积）通过考虑每个载体的病毒接种物体积来确定每个载体的病毒滴度。计算方法为将1.0ml除以每个载体的总病毒接种物。每个载体的病毒滴度，其中：1.每个载体接种物体积因子=Log₁₀[1.0ml/每个载体病毒接种物体积]2.每个载体的病毒滴度=TCID₅₀/0.1ml+每个载体接种物体积因子

因测试物质暴露导致的病毒灭活计算：回收对照Log₁₀TCID₅₀-经测试物质处理后的病毒Log₁₀TCLD₅₀=因测试物质灭活导致的病毒Log₁₀减少量

研究结果：测试微生物测试物质接触时间重复次数病毒滴度（Log₁₀/0.1mL）平均病毒滴度（Log₁₀/0.1mL）平均百分比减少率（%）平均Log₁₀减少值猫杯状病毒ATCCVR-782零时刻对照（病毒初始滴度）1≥7.5≥7.5N/A2≥7.5Z-71MicrobeShield处理组10分钟14.254.63≥99.87%≥2.882524小时1≤3.50≤3.5099.99%≥4.002≤3.50

注：本检测的检测限为每0.100mL3.50log₁₀感