CN115093464B 预测祖先病毒序列的方法及其用途 （马萨诸塞眼科耳科诊所）

201480065410.22014.10.10WO03089612A2,2003.10描述了用于预测病毒或其部分的祖先序列的方法。还描述了腺伴随病毒(AAV)壳体多肽的经预27.权利要求6的病毒颗粒在制备用于基因转移的组合物中的用途，其中所述组合物用将权利要求6的病毒颗粒施用于需要基因转8.权利要求6的病毒颗粒在制备用于用转基因进行疫苗接种的组合物中的用途，其中将权利要求6的病毒颗粒施用于需要疫苗接9.权利要求1的AAV壳体多肽在制备用于对受试者接将可操作连接于权利要求1的AAV壳体多肽的靶抗原施用于需要疫苗接3[0003]规避和避免针对基因治疗载体的中和性或毒性免疫应答是所有基因转移载体类型面临的重大挑战。迄今为止的基因转移使用基于在人类和动物中循环的病毒的载体(例安全风险和降低的效率。病毒壳体抗原主要负责针对病毒颗粒的天然免疫和/或适应性免[0004]本公开描述了预测和合成祖先病毒(ancestralviral)序列或其部分的方法，并且还描述了含有此类祖先病毒序列的病毒颗粒。将本文中描述的方法应用到腺伴随病毒多肽的病毒颗粒与AAV8壳体多肽或包含AAV8壳体多肽的病毒颗粒展现出大致相同或更低体多肽或包含AAV2壳体多肽的病毒颗粒在更小程度上被人血清中和，并且AAV壳体多肽或包含AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV8壳体多肽或包含AAV8壳体多肽的病毒颗粒在相似或更[0007]在另一个方面，本公开提供了纯化的病毒颗粒，其包括本文中所述的AAV壳体多4体多肽或包含AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV2壳体多肽或包含AAV2壳体多肽的病毒颗粒展或包含AAV8壳体多肽的病毒颗粒展现出大致相同或更低的血清阳性率。在一些实施方案毒颗粒在更小程度上被人血清中和，并且AAV壳体多肽或包含AAV壳体多肽的病毒颗粒比[0009]在另一个方面，本文中描述的AAV壳体多肽可以通过如本文所描述的核酸序列编[0010]在另一个方面，本公开提供了包括本文中所述的AAV壳体多肽中的至少一种的病毒颗粒比AAV8病毒颗粒在相似或更小程度上被人[0012]在一个方面，本公开提供了将可操作连接于如本文中所述的AAV壳体多肽的靶抗[0013]在另一个方面，本公开提供了预测祖先病毒或其部分的序列的计算机方法(in测的祖先系统发生(phylogeny)；在预测的祖先系统发生的系统发生节点(phylogenicnode)处估计在序列的每个位置上的特定核苷酸或氨基酸残基的进化概率(evolutionaryprobability)并且基于估计的在每个位置上的概率预测祖先病毒或其部分5病毒(parainfluenzavirus)和泡沫病中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV8壳体多肽或包含AAV8壳体多肽的病毒颗粒展现出相同或更低的血清阳性率其中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒与AAV8壳体多肽或包含AAV8壳[0024]6.编码腺伴随病毒(AAV)壳体多肽的核酸6其中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒比AAV8壳体多肽或包含AAV8壳且其中所述AAV壳体多肽或包含所述AAV壳体多肽的病毒颗粒与AAV8壳体多肽或包含AAV8壳体多肽的病毒颗粒在相似或更小程度上被人[0033]15.实施方案11-14中任一项的AAV[0034]16.实施方案11-14中任一项的AAV[0038]将实施方案10或实施方案18的病毒颗粒施用于需要基因转移或免疫接种的受试[0039]20.实施方案19的方法，其中所述病毒[0040]21.实施方案19的方法，其中所述病[0042]将可操作连接于实施方案1或实施方案11的AAV壳体多肽的靶抗原施用于需要疫[0045]25.预测祖先病毒或其部分的序列的计算机方法(in[0049]在所述预测的祖先系统发生的系统发生节点处估计在所述序列的每个位置上的7[0053]28.实施方案27的方法，其中所述MSA算法是概率比对套件(Probabilistic[0055]30.实施方案25至28中任一项的方法，其中使用JTT模型及伽马分布模型(Gamma[0057]32.实施方案25至31中任一项的方法，[0058]33.实施方案32的方法，其进一步包[0059]34.实施方案33的方法，其进一步包括对所述祖先病毒颗粒筛选下列至少一项：[0060]35.实施方案34的方法，其中所述祖先[0061]36.实施方案34的方法，其中所述祖先[0062]37.实施方案25的方法，其中组的家族：腺病毒(adenovirus)(virus)(HSV)，痘苗病毒(vacciniavirus)，痘病毒(poxvirus)，流感病毒(influenzavirus)，呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus)，副流感病毒(parainfluenza[0064]图1是显示祖先病毒/当代病毒感染和祖先宿主/当代宿主免疫应答之间的关系的[0065]图2的a至d图是显示祖先重建(reconstruction)过程的实例的一系列示意图。显[0069]图6是凝胶电泳图，其证明祖先AAVVP1序列以类似于当代AAVVP1序列的方式被8[0072]图9是显示Anc80文库和Anc80L65之间的序列比较(从对角线向上以下的氨基图A显示了Anc80L65能够产生与AAV2相当的载体产率；图B是包括Anc80L65的病毒颗粒的[0074]图11的A-C是实验结果的图像，其证明了使用GFP作为读数(图A)或萤光素酶(图[0075]图12的A-D的图表明在使用IVIg(图A)或来自比利时群体的血清(图B)，来自波士顿群体的血清(图C)或来自食蟹猴(Cynomolgusmacaques)的血清(图D)的人类群体中，[0076]图13A和13B是使用MAFFT产生的序列同一性矩阵，其显示与代表性现存的AAV的VP1蛋白的氨基酸序列比对的祖先载体的VP1蛋白的氨基酸序列(图13A)，和与代表性现存的AAV的VP3蛋白的氨基酸序列比对的祖先载体的V[0079]图16是照片，其显示将每一载体的1.9E3GC[0080]图17是显示实验结果的图，其中裂解来自图16的相同细胞并测定萤光素酶表[0082]图19的图提供了测定本文中所述的祖先AAV载体的相对产生和感染性的体外实验[0083]基因转移(出于实验或治疗目的)依赖于载体或载体系统将遗传信息穿梭到靶细9[0084]然而，血清阳性率研究指示相当大比例的全球人类群体已经预先暴露(例如通过病毒或其部分比当代病毒或其部分在当前人类群体中展现出降低的对先前存在的免疫的[0085]图1是显示祖先和当代病毒感染与祖先和当代宿主免疫应答之间的关系的示意所述祖先病毒种类就表位组成而言可以与现存病毒实质[0088]为了预测祖先病毒序列，首先从多个当代病毒或其部分编译(compile)核苷酸或[0090]此类序列可以例如从许多公共数据库获得，所述公共数据库包括但不限于GenBank,UniProt,EMBL，国际核苷酸序列数据库协作(InternationalNucleotideSequenceDatabaseCollaboration)(INSDC)或欧洲核苷酸档案不同的输入(例如，核酸或蛋白质)，以及适用于以特定方式(例如，动态编程，渐进例如ClustalW(Thompsonetal.,1994,Nuc.AcidsRes.,22:4673-90),Kalign(Lassmannetal.,2006,Nuc.AcidsRes.,34:W596-99),MAFFT(Katohetal.,2005,Nuc.AcidsRes.,33:511-8),MUSCLE(Edgar,2004,BMCBioinform.,5:113),和T-Coffee(Notredame[0092]如本文中所述的，当选择MSA算法用于本文中所述的方法中时的主要特征之一是其中所述算法处理比对中的缺口的方式。可以给序列比对中的缺口分配罚分值(penalty中处理缺口的合适的方法描述于LoytynojaandGoldman,2008,Science,320:1632-5中，并且将缺口以适合用于本文中所述的方法中的方式应用于比对中的商业上可获得的算法是概率比对套件(ProbabilisticAlignmentKit)(PRANK；GoldmanGroupSoftware；LoytynojaandGoldman,2005,PNASUSA,102:10557-62)和PRAN[0093]然后，将进化模型应用到得到的比对以获得预测的祖先系统发生(参见图2的矩阵。应用进化模型的算法包括但不限于Dayhoff模型(例如PAM120,PAM160,PAM250；Dayhoffetal.,1978,InAtlasofProteinSequenceandStructure(ed.Dayhoff),pp.345-52,NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonD.C.),JTT模型(Jonesetal.,1992,Comp.Appl.Biosci.,8:275-82),WAG模型(WhelanandGoldman,2001,Mol.Biol.Evol.,18:691-9),和Blosum模型(例如Blosum45,Blosum62,Blosum80；HenikoffandHenikoff,1992,PNAS[0095]可以使用Aikake信息标准(AIC；Akaike,1973,InSecondInternationalSymposiumonInformationTheory,PetrovandCsaki,eds.,pp267-81,Budapest,[0096]如下文实施例部分中解释的，基于最统发生树。构建系统发生树在本领域是已知的，并且通常使用最大似然法(maximumlikelihoodmethod)，如由PhyML(GuindonandGascuel,2003,SystematicBiology,52:696-704)),MOLPHY(AdachiandHasegawa,1996,ed.TokyoInstituteofStatisticalMathematics),BioNJ(Gascuel,1997,Mol.Biol.Evol.,14:685-95)或PHYLIP理解，在氨基酸取代的模型中计算复杂性和拟合优度(goodnessoffit)之间的平衡是值评估模型的显著性，包括但不限于自助法(bootstrap)，刀切法(jackknife)，交叉验证Gascuel,2006,SystematicBiology,55:539-52)进是指与不考虑例如密码子选择中的进化偏移(evolutionaryshift)的模型形成对比基于然法，包括但不限于通过最大似然法进行的系统发生分析(PhylogeneticAnalysisby进行的系统发生分析(PhylogeneticAnalysisUsingParsimony)(PAUP；SinauerAssoc.,Inc.,Sunderland,MA)评估考虑了在特定位置上的特定核苷酸或氨基酸残基的进90％的序列同一性)的一种或多种当代序列设计，并且可以将如本文中描述的祖先序列针[0102]本文中概述的用于预测祖先病毒序列的任何或全部有步骤可以使用处理器或微处理器在计算机上(例如用计算机(insilico))[0104]使用当代壳体序列将本文中描述的方法应用到腺伴随病毒(AAV)(在以下实施例活病毒颗粒比用当代壳体多肽装配的病毒颗粒展现出更小的血清阳性率，在一些情况下，核酸分子和/或多肽。基于例如计算机获得的序列产生人工核酸分子或多肽的方法在本领列)瞬时或稳定地引入到包装宿主细胞中。病毒颗粒的一种或多种组分可以基于如本文所基于预测的祖先序列。是从制备它们的混合物中的组分取出的病毒颗粒，所述组分如但不限于病毒组分(例如，病毒颗粒是否结合到其受体在本领域中是常规的，并且这样的方法可以在体外或体内进[0114]确定病毒颗粒的血清阳性率在本领域中是常规进行的并且通常包括使用免疫测定法来确定来自个体的特定群体的样品(例如，血液样品)中的一种或多种抗体的阳性率原体或免疫原)的受试者的比例，并计算为群体中产生针对特定病原体或免疫原的抗体的etal.(2007,Am.J.Obstet.Gynecol.,196:43量与没有抗体的对照样品相比，实验样品含有中和感染达50％或更多的抗体浓度的滴度。还可参见Fisheretal.(1997,NatureMed.,3:306-12)和Manningetal.(1998,Human[0116]就本文示例性的祖先AAV壳体多肽而言，可以例如与AAV8壳体多肽或者包括AAV8率和/或中和的程度。本领域通常理解AAV8壳体多肽或病毒颗粒在人类群体中展现出认为约43.5％直至约72％的血清阳性率。参见例如,Boutinetal.,2010,“PrevalenceofserumIgGandneutralizingfactorsagainstAAVtypes1,2,5,6,8and9inthehealthypopulation:implicationsforgen[0118]对来自编码从Anc80节点预测的祖先壳体多肽的文库的多种不同克隆进行了测(Anc80L65)；SEQIDNO:24(Anc80L33)；SEQIDNO:25(Anc80L36)；和SEQIDNO:26肽具有至少95％的序列同一性(例如，至少96至少97至少98至少99％或100％的[0121]可以使用由Altschul等人(1997,NucleicAcidsRes.,25:33893402)所描述的行BLAST搜索，以确定使用Altschul等人的算法比对的序列(核酸或氨基酸)和任何其它序象(artifact)。图5A和5B显示了祖先AAVVP1壳体多肽(Anc80L65(SEQIDNO:23),NO:20))和当代AAVVP1壳体多肽(AAV8(SEQIDNO:27),AAV9(SEQIDNO:28),AAV6(SEQIDNO:33),和AAV7(SEQIDNO:34)之间的比对。在图5A和5B的比对显示祖先AAV序与当代AAV序列的约85％至91％之间的序如，限制性酶消化和连接)或聚合酶链式反应(PCR；参见例如PCRPrimer:ALaboratoryManual,Dieffenbach&Dveksler,Eds.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)可文所述的祖先病毒或其部分可以用于人或动物医学中以用于基因治疗(例如，用于基因转miRNA海绵擦拭(miRNAsponging)，遗传免疫，光遗传学基因治疗(optogeneticgene中)转导或感染宿主细胞。本文描述了可以用祖先病毒或其部分在体外转导或感染的宿主[0130]可以修饰如本文所述的祖先病毒或部分以包括转基因(与其它病毒序列为顺式或括抗原标签域如血凝素或Myc)或治疗性基因(例如，编码激素或其受体，生长因子或其受天性黑朦(lebercongenitalamaurosis)，溶酶体贮积症，先天性代谢缺陷(inbornerrorsofmetabolism)(例如，先天性氨基酸代谢缺陷(inbornerrorsofaminoacid缺陷(inbornerrorsoffattyacidmetabolism)，包括中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(medium-chainacyl-CoAdehydrogenasedeficiency,MCAD))，癌症，全色盲黄斑变性)，脂多肽脂酶缺陷，家族性高胆固醇血症，脊髓性肌萎缩，杜氏肌营养不良综合征(Marfan’ssyndrome)，致死性家族性失眠(fatalfamilialinsomnia)，受症(lactoseintolerance)，脂肪沉积症(lipidstoragedisorder)(如C型Niemann-Pick症)，Batten病，无脉络膜(choroideremia)，糖原贮积病Ⅱ型(庞皮病(Pompe天性甲状腺功能减退症(congenitalhypothyroidism)，严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency,SCID)，和/或肌萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateral[0133]可将通常悬浮在生理上相容的载体中的祖先病毒或其部分施用于受试者(例如人1012基因组拷贝(GCS)的浓度的祖先病[0135]本文描述的方法还可以用于对向前进化(forwardevolution)建模，以便修饰或述实施例不限制权利要求书中描述的方法和组合[0140]将ProtTest3(参见例如Da在万维网上以darwin.uvigo.es/software/prottest3可得到)用于在不同条件下(例如在Blosum62,VT,HIVb,MtArt,MtMam)。基于如在ProTest3中实施的Aikake信息标准(AIC；Hirotugu,1974,IEEETransactionsonAutomaticControl,19:716-23)得分选择JTT模型(Jonesetal.,1992,Comp.Appl.Biosci.,8:275-82)与+G和+F(Yang,1993,[0141]使用PhyML(GuindonandGascuel,2003,SystematicBiology,52:696-704)构建代模型产生树。通过近邻交换(NearestNeighborInterchange)(NNI)和子树修剪(SubtreePruning)和再移植术(SPR)改进得到的树，并通过自助法和近似似然比检验[0142]然后，将以上构建的系统发生树用于在系统发生内部的每个节点估计AAV壳体的统发生分析(PhylogeneticAnalysisbyMaximumLikelihood,PAML)软件(Yang,1997,选择密码子。编写了脚本以得出与另一个AAV序列(AVVRh10，其具有与Anc80支架序列约[0146]使用Needleman-Wunsch使用用于评分的Blosum62表比对Pi与Pt。通过步进[0148]来自密码子-PAM矩阵(Codon-PAMmatrix)(Schneideretal.,2005,[0151]此外，还产生两个单核苷酸变化以消除装配激活蛋白(assembly-activating[0154]克隆了许多预测的祖先AAV壳体序列。将祖先壳体文库转移到r使得能够在瞬时转染中形成病毒颗粒。为了维通过切割位于rep编码序列中的cap的5’的HindIII和在cap终止密码子和多聚腺苷酸化信号之间工程化改造的SpeI，克隆了文库cap基因。因此，为了将祖先壳体克隆到更常规的rep/cap质粒中。[0157]通过瞬时共转染编码病毒颗粒装配需要的所有元件的质粒在HEK293细胞中产生行彻底的DNA消化的条件下用酶(本文用BenzonaseTM)处理，以消化存在于病毒颗粒外的任组相比具有相同的TaqManTM引物和探针结合序列的线性化质粒。用退火至选择的病毒载体基因组的引物和探针进行TaqManTMPCR。基于TaqManTM测量以每毫升(ml)中的基因组拷贝4.17x1010[0161]在祖先重构建的AAV壳体颗粒上的小规模载体生产结果表明类似于AAV2，但相对于AAV8减少(这两者都是基于当代AAV[0164]在使用Anc80序列文库进行高通量载体生产后，用每一病毒载体转导HEK293细胞定量后，产生了在四个级联96孔板中的萤光素酶表达的热图(排除在每个板中的对照栏)。[0165]用两个当代AAV载体(AAV2/2和AAV2/8)和三个预测的祖先AAV载体(Anc80L27，Anc80L44，和Anc80L65)以每细胞1×104个基因组拷贝(GC)的相等的多重感染(MOI)转导HEK293细胞。每个载体含有萤光素酶编码转基因或eGFP编码转基因。60小时后使用AMG祖先AAV病毒表明HEK293细胞的有[0168]用2×108基因组拷贝(GC)的三种不同的祖先AAV(Anc80L27,Anc80L44,和照相术非侵入性监测GFP表达。所有呈现的视网膜表明将祖先AAV不同程度成功靶向视网如上所述的Anc80L65祖先AAV载体转导的鼠视网膜上进行组织学。Anc80L65介导的eGFP表[0171]进行中和抗体测定，以评估祖先AAV病毒是否比当代AAV病毒对抗体中和更具抗[0172]2倍连续稀释血清样品或IVIG储备溶液(200mg/ml)，并且未稀释和稀释的样品与验，所用的抗体样品是静脉内免疫球蛋白(IVIG)，从超过1000名血液供体(市售，例如，GammagardTM(BaxterHealthcare；Deerfield,IL)或GamunexTM[0173]如图8所示，为将祖先AAV病毒Anc80L65的转导效率降低至50％的无IVIG对照(虚且称为Anc80L1(SEQIDNO：35显示Anc80L1壳体的核酸序列并且SEQIDNO：36显示Anc80L1VP1多肽的氨基酸序列)。还使用本文描述的序列通过商业公司合成Anc80概率文[0178]图10显示了Anc80L65产生与AAV2相当的载体产率(图A)，在透射电镜法(TransmissionElectroscopy,TEM)下产生病毒颗粒(B图)，并且基于变性条件下的SDSPAGE(C图)和使用AAV壳体抗体B1进行的Western印迹法(图D)在生物化学上产生AAVcap和[0179]简要地，小规模生产了含有报道构建体的AAV2/8,AAV2/2,AAV2/Anc80L27,AAV2/Anc80L44,和AAV2/Anc80L65载体，所述报告构建体由CMV启动子控制下的eGFP和萤火虫萤光素酶构成。然后通过qPCR获得病毒的这些小规模制备物的滴度。基于这些实验，发现射电子显微术(TEM)获得显微照片。将大规模的纯化的Anc80-L065制备物装载到聚乙烯醇缩甲醛(polyvinylformal)(FormvarB)涂覆的铜网格上，然后用乙酸双氧铀(uranylacetate)染色。显微照片揭示了具有20至25nm之间直径的完整的，六角形的颗粒(图10的将AAV2/8，AAV2/2，和AAV2/Anc80L65载体的大规模纯化的制备物装载到SDS凝胶在(图10的C)。用AAV壳体抗体B1进行的Western印迹法进一步证实这些条带代表预测的蛋[0183]为获得祖先病毒体的感染性的相对测量，产生含有双顺反子报道构建体的AAV2/2,AAV2/8,AAV2/Anc80L65,AAV2/Anc80L44,AAV2/Anc80L27,AAV2/Anc80L121,AAV2/MOI(通过如上所述的qPCR获得的滴度)用每一载体转导以HEK293细胞汇合的96孔板。48小酶的存在(图11的B)，这确定了用Anc80衍生的载体转导的细胞中萤光素酶的表达是在用[0184]为了评估在体内情况下基因转移的相对效率，得到AAV2/2,AAV2/8和AAV2/壳体化在TBG启动子控制下的编码核LacZ的转基因)注射到C57BL/6小鼠(每个条件3只小[0186]获得了相同血清型的载体，此次壳体化在CMV启动子控制下的仅编码eGFP转基因[0187]图12显示实验结果，其中相对于现存的AAV病毒载体评估祖先病毒载体的血清阳12的C)或波士顿个体的血清(n＝102；图12的B)显示相对于AAV2,8对中和Anc80L65的降低因治疗载体的不同AVV载体)的类似的血清阳性率。从食蟹猴获得的血清展示出相比于[0188]简言之，获得了AAV2/8,AAV2/2,AAV2/rh32.33和AAV2/Anc80L65病毒载体的纯化的高滴度制备物，所述病毒载体壳体化包括在CMV启动子控制下的eGFP和萤火虫萤光素酶估了从食蟹猕猴获得的血清(图12的D)，其中发现相比于AAV2，AAV8和Rh.32.33载体，[0190]然后通过商业实验室(Gen9)合成最有可能的祖先AAV壳体序列(如通过后验概率确定)并以线性dsDNA提供。然后将这些氨基酸序列与现存AAV的氨基酸序列相比较以确定[0191]然后将这些质粒中的每一个用于产生AAV载体，其含有编码eGFP和萤火虫萤光素用于设立滴度对照实验以评估相对感染性。Anc126由于其显著降低的产生而没有滴度对照，因此，关于Anc126的感染性的数据不能与实验中其他病毒的感染性准确相比。以[0195]在有载体(vectored)的免疫预防中，将基因治疗载体(如AAV)用于递送编码针对(etiologicagent)的终生保护的[0197]LUCENTIS@(兰尼单抗(ranibizumab))和阿瓦斯丁(AVASTIN)(贝伐单抗)均是基于针对血管内皮生长因子A(VEGF-A)的相同的人源化小鼠单克隆抗体的抗血管生成[0002]<110>马萨诸塞眼科耳科诊所[0003]<120>预测祖先病毒序列的方法及其用途[0004]<130>00633-0155WO1[0005]<140>PCT/US2014/060163[0006]<141>2014-10-10[0007]<150>61/889,827[0008]<151>2013-10-11[0010]<170>PatentIn版本3.5[0014]<213>腺伴随病毒[0018]<223>/替换="Arg"[0022]<223>/替换="Ser"[0026]<223>/替换="Gly"[0030]<223>/替换="Lys"[0034]<223>/替换="Gln"[0038]<223>/替换="Glu"[0042]<223>/替换="Thr"[0046]<223>/替换="Asn"[0050]<223>/替换="Glu"[0054]<223>/替换="Ala"[0058]<223>/替换="Asp"[0060]<221>misc_feature[0062]<223>/注意="序列中给出的变体残基相对于变体位置的注解中的那些残基没有偏爱"[0064]MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer[0066]GluGlyIleArgGluTrpTrpAspLeuLysProGlyAlaProLysPro[0068]LysAlaAsnGlnGlnLysGlnAspAspGlyArgGlyLeuValLeuPro[0070]GlyTyrLysTyrLeuGlyProPheAsnGlyLeuAspLysGlyGluPro[0072]ValAsnAlaAlaAspAlaAlaAlaLeuGluHisAspLysAlaTyrAsp[0074]GlnGlnLeuLysAlaGlyAspAsnProTyrLeuArgTyrAsnHisAla[0076]AspAlaGluPheGlnGluArgLeuGlnGluAspThrSerPheGlyGly[0078]AsnLeuGlyArgAlaValPheGlnAlaLysLysArgValLeuGluPro[0080]LeuGlyLeuValGluGluGlyAlaLysThrAlaProGlyLysLysArg[0082]ProValGluGlnSerProGlnGluProAspSerSerSerGlyIleGly[0084]LysLysGlyGlnGlnProAlaLysLysArgLeuAsnPheGlyGlnThrGlyAspSerGluSerValProAspProGlnProLeuGlyGluProProAlaAlaProSerGlyValGlySerAsnThrMetAlaAlaGlyGlyGly200205AlaProMetAlaAspAsnAsnGluGlyAlaAspGlyValGlyAsnAla210215220SerGlyAsnTrpHisCysAspSerThrTrpLeuGlyAspArgVal225230235240ThrThrSerThrArgThrTrpAlaLeuProThrTyrAsnAsnHisLeu245250255TyrLysGlnSerSerGlnSerGlyAlaSerThrAsnAspAsnThr260265270TyrPheGlyTyrSerThrProTrpGlyTyrPheAspPheAsnArgPhe275280285HisCysHisPheSerProArgAspTrpGlnArgLeuAsnAsnAsn290295TrpGlyPheArgProLysArgLeuAsnPheLysLeuPheAsnGlnValLysGluValThrThrAsnAspGlyThrThrThrAlaAsnAsnLeuThrSerThrValGlnValPheThrAspSerGluTyrGlnLeuProTyrValLeuGlySerAlaHisGlnGlyCysLeuProProPheProAlaAspValPheMetProGlnTyrGlyTyrLeuThrLeuAsnAsnGlySerGlnAlaValGlyArgSerSerPheTyrCysLeuGluTyrPhePro400SerGlnMetLeuArgThrGlyAsnAsnPheGluPheSerTyrThrPhe405410415GluAspValProPheHisSerSerTyrAlaHisSerGlnSerLeuAsp420425430ArgLeuMetAsnProLeuAspGlnTyrLeuTyrTyrLeuSerArg435440445ThrGlnThrThrSerGlyThrAlaGlyAsnArgThrLeuGlnPheSer450455460GlnAlaGlyProSerSerMetAlaAsnGlnAlaLysAsnTrpLeuPro465470475480GlyProCysTyrArgGlnGlnArgValSerLysThrAlaAsnGlnAsn485490495[0126]AsnAsnSerAsnPheAlaTrpThrGlyAlaThrLysTyrHisLeuAsnGlyArgAspSerLeuValAsnProGlyProAlaMetAlaThrHisLysAspAspGluAspLysPhePheProMetSerGlyValLeuPheGlyLysGlnGlyAlaGlyAsnSerAsnValAspLeuAspAsnValMetThrSerGluGluGluLysThrThrAsnProValAlaThrGluGlnTyrGlyThrValAlaThrAsnLeuGlnSerSerAsnThrAlaProAlaThrGlyThrValAsnSerGlnGlyAlaLeuProGlyMetValTrpGln600605AsnArgAspValTyrLeuGlnGlyProTrpAlaLysProHis610615620ThrAspGlyHisPheHisProSerProLeuMetGlyGlyPheGlyLeu625630635640LysHisProProProGlnLeuLysAsnThrProValProAla645650655AsnProProThrThrPheSerProAlaLysPheAlaSerPheThr660665670GlnTyrSerThrGlyGlnValSerValGluGluTrpGluLeuGln675680685LysGluAsnSerLysArgTrpAsnProGluGlnTyrThrSerAsn690695TyrAsnLysSerThrAsnValAspPheAlaValAspThrAsnGlyValTyrSerGluProArgProGlyThrArgTyrLeuThrArgAsnLeu<210>2<211>2208<212>DNA<213>腺伴随病毒<220><221>变异<223>/替换="aaa"<220>[0167]<223>/替换="agc"[0171]<223>/替换="ggc"[0175]<223>/替换="aag"[0179]<223>/替换="cag"[0183]<223>/替换="gag"[0187]<223>/替换="acc"[0191]<223>/替换="aac"[0195]<223>/替换="gag"[0199]<223>/替换="gcc"[0203]<223>/替换="gac"[0205]<221>misc_feature[0207]<223>/注意="序列中给出的变异核苷酸相对于变异位置注解中的那些核苷酸没有偏爱"[0209]atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgc60gagtggtgggacttgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacgacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgac240cagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccaggccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcct420ggaaagaagagaccggtagagcaatcaccccaggaaccagactcctcttcgggcatcggc480aagaaaggccagcagcccgcgaagaagagactcaactttgggcagacaggcgactcagagtcagtgcccgaccctcaaccactcggagaaccccccgcagccccctctggtgtgggatct600aatacaatggcagcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacgga660gtgggtaacgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgaacctgggccctccccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccagccaatcgggagcaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccctgg840gggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcgactc900atcaacaacaactggggattccggcccaagagactcaacttcaagctcttcaacatccag960gtcaaggaggtcacgacgaatgatggcaccacgaccatcgccaataaccttaccagcacggttcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtcctcggctctgcgcaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctgactctgaacaatggcagtcaggccgtgggccgttcctccttctactgcctggagtactttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgagttcagctacacgtttgaggacgtgccttttcacagcagctacgcgcacagccaaagcctggaccggctgatgaaccccctcatcgaccagtacctgtactacctgtctcggactcagaccacgagtggtaccgcaggaaatcggacgttgcaattttctcaggccgggcctagtagcatggcgaatcaggccaaaaactggctacccgggccctgctaccggcagcaacgcgtctccaagacagcgaatcaaaataacaacagcaactttgcctggaccggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtaaatcccggtcccgctatggcaacccacaaggacgacgaagacaaattttttccgatgagcggagtcttaatatttgggaaacagggagctggaaatagcaacgtggaccttgacaacgttatgataaccagtgaggaagaaattaaaaccaccaacccagtggccacagaacagtacggcacggtggccactaacctgcaatcgtcaaacaccgctcctgctacagggaccgtcaacagtcaaggagccttacctggcatggtctggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcctatctgggccaagattcctcacacggacggacactttcatccctcgccgctgatgggaggctttggactgaaacacccgcctcctcagatcctgattaagaatacacctgttcccgcgaatcctccaactaccttcagtccagctaagtttgcgtcgttcatcacgcagtacagcaccggacaggtcagc2040gtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaacccagagattcaa2100[0244]tacacttccaactacaacaaatctacaaatgtggactttgctgttgacacaaatggcgtt2160[0245]tattctgagcctcgccccatcggcacccgttacctcacccgtaatctg2208[0249]<213>腺伴随病毒[0253]<223>/替换="Ser"[0257]<223>/替换="Arg"[0261]<223>/替换="Ser"[0265]<223>/替换="His"[0269]<223>/替换="Lys"[0273]<223>/替换="Gln"[0277]<223>/替换="Gln"[0281]<223>/替换="Glu"[0285]<223>/替换="Ser"[0289]<223>/替换="Tyr"[0293]<223>/替换="Ser"[0297]<223>/替换="Asn"[0301]<223>/替换="Ile"[0305]<223>/替换="Ser"[0309]<223>/替换="Thr"[0311]<221>misc_feature[0313]<223>/注意="序列中给出的变体残基相对于变体位置的注解中的那些残基没有偏爱"[0315]MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer[0317]GluGlyIleArgGluTrpTrpAspLeuLysProGlyAlaProLysPro[0319]LysAlaAsnGlnGlnLysGlnAspAspGlyArgGlyLeuValLeuPro[0321]GlyTyrLysTyrLeuGlyProPheAsnGlyLeuAspLysGlyGluPro[0323]ValAsnAlaAlaAspAlaAlaAlaLeuGluHisAspLysAlaTyrAsp[0325]GlnGlnLeuLysAlaGlyAspAsnProTyrLeuArgTyrAsnHisAla[0327]AspAlaGluPheGlnGluArgLeuGlnGluAspThrSerPheGlyGly[0329]AsnLeuGlyArgAlaValPheGlnAlaLysLysArgValLeuGluPro[0331]LeuGlyLeuValGluGluGlyAlaLysThrAlaProGlyLysLysArg[0333]ProValGluGlnSerProGlnGluProAspSerSerThrGlyIleGly[0335]LysLysGlyGlnGlnProAlaLysLysArgLeuAsnPheGlyGlnThrGlyAspSerGluSerValProAspProGlnProLeuGlyGluProProAlaAlaProSerGlyValGlySerAsnThrMetAlaAlaGlyGlyGly200205AlaProMetAlaAspAsnAsnGluGlyAlaAspGlyValGlyAsnAla210215220SerGlyAsnTrpHisCysAspSerThrTrpLeuGlyAspArgVal225230235240ThrThrSerThrArgThrTrpAlaLeuProThrTyrAsnAsnHisLeu245250255TyrLysGlnSerAsnSerGlnSerGlyGlySerThrAsnAspAsn260265270ThrTyrPheGlyTyrSerThrProTrpGlyTyrPheAspPheAsnArg275280285PheHisCysHisPheSerProArgAspTrpGlnArgLeuAsnAsn290295AsnTrpGlyPheArgProLysArgLeuAsnPheLysLeuPheAsnGlnValLysGluValThrThrAsnAspGlyThrThrThrAlaAsnAsnLeuThrSerThrValGlnValPheThrAspSerGluTyrGlnLeuProTyrValLeuGlySerAlaHisGlnGlyCysLeuProProPheProAlaAspValPheMetProGlnTyrGlyTyrLeuThrLeuAsnAsnGlySerGlnAlaValGlyArgSerSerPheTyrCysLeuGluTyrPhe400ProSerGlnMetLeuArgThrGlyAsnAsnPheGluPheSerTyrThr405410415PheGluAspValProPheHisSerSerTyrAlaHisSerGlnSerLeu420425430AspArgLeuMetAsnProLeuAspGlnTyrLeuTyrTyrLeuSer435440445ArgThrGlnThrThrGlyGlyThrAlaGlyAsnArgThrLeuGlnPhe450455460SerGlnAlaGlyProSerSerMetAlaAsnGlnAlaLysAsnTrpLeu465470475480ProGlyProCysTyrArgGlnGlnArgValSerLysThrThrAsnGln485490495AsnAsnAsnSerAsnPheAlaTrpThrGlyAlaThrLysTyrHisLeu[0379]AsnGlyArgAspSerLeuValAsnProGlyValAlaMetAlaThrHis[0381]LysAspAspGluAspArgPhePheProSerSerGlyValLeuIlePhe[0383]GlyLysGlnGlyAlaGlyAsnAspAsnValAspLeuAspAsnValMet[0385]IleThrSerGluGluGluIleLysThrThrAsnProValAlaThrGlu[0387]GluTyrGlyValValAlaThrAsnLeuGlnSerAlaAsnThrAlaPro[0389]GlnThrGlyThrValAsnSerGlnGlyAlaLeuProGlyMetValTrp[0391]GlnAsnArgAspValTyrLeuGlnGlyProIleTrpAlaLysIlePro[0393]HisThrAspGlyAsnPheHisProSerProLeuMetGlyGlyPheGly[0395]LeuLysHisProProProGlnIleLeuIleLysAsnThrProValPro[0397]AlaAsnProProThrThrPheSerProAlaLysPheAlaSerPheIle[0399]ThrGlnTyrSerThrGlyGlnValSerValGluIleGluTrpGluLeu[0401]GlnLysGluAsnSerLysArgTrpAsnProGluIleGlnTyrThrSer[0403]AsnTyrAsnLysSerThrAsnValAspPheAlaValAspThrGluGly[0405]ValTyrSerGluProArgProIleGlyThrArgTyrLeuThrArgAsn[0411]<213>腺伴随病毒[0415]<223>/替换="agc"[0419]<223>/替换="aag"[0423]<223>/替换="agt"[0427]<223>/替换="cac"[0431]<223>/替换="aag"[0435]<223>/替换="cag"[0439]<223>/替换="cag"[0443]<223>/替换="gag"[0447]<223>/替换="agc"[0451]<223>/替换="tac"[0455]<223>/替换="agc"[0459]<223>/替换="aac"[0463]<223>/替换="atc"[0467]<223>/替换="agc"[0471]<223>/替换="acc"[0473]<221>misc_feature[0475]<223>/注意="序列中给出的变异核苷酸相对于变异位置注解中的那些核苷酸没有偏爱"[0477]atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgc60[0478]gagtggtgggacttgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggac120[0479]gacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgac180[0480]aagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgac240[0481]cagcagctcaaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataaccacgccgacgccgagttt300[0482]caggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgagcagtcttccag360[0483]gccaagaagcgggttctcgaacctctcggtctggttgaggaaggcgctaagacggctcct420[0484]ggaaagaagagaccggtagagcaatcaccccaggaaccagactcctctacgggcatcggc480[0485]aagaaaggccagcagcccgcgaaaaagagactcaactttgggcagactggcgactcagag540[0486]tcagtgcccgaccctcaaccactcggagaaccccccgcagccccctctggtgtgggatct600[0487]aatacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacgga660[0488]gtgggtaatgcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatc720[0489]accaccagcacccgaacctgggccctccccacctacaacaaccacctctacaagcaaatc780[0490]tccaacagccaatcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccc840[0491]tgggggtattttgactttaacagattccactgccacttctcaccacgtgactggcagcga900[0492]ctcatcaacaacaactggggattccggcccaagagactcaacttcaagctcttcaacatc960[0493]caggtcaaggaggtcacgacgaatgatggcaccacgaccatcgccaataaccttaccagc1020[0494]acggttcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtcctcggctctgcgcac1080[0495]cagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctg1140[0496]actctgaacaatggcagtcaggccgtgggccgttcctccttctactgcctggagtacttt1200[0497]ccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgagttcagctacacgtttgaggacgtg1260[0498]ccttttcacagcagctacgcgcacagccaaagcctggaccggctgatgaaccccctcatc1320[0499]gaccagtacctgtactacctgtctcggactcagaccacgggaggtaccgcaggaaatcgg1380[0500]acgttgcaattttctcaggccgggcctagtagcatggcgaatcaggccaaaaactggcta1440[0501]cccgggccctgctaccggcagcaacgcgtctccaagacaacgaatcaaaataacaacagc1500[0502]aactttgcctggaccggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtaaat1560[0503]cccggtgtcgctatggcaacccacaaggacgacgaagaccgattttttccgtccagcgga1620[0504]gtcttaatatttgggaaacagggagctggaaatgacaacgtggaccttgacaacgttatg1680[0505]ataaccagtgaggaagaaattaaaaccaccaacccagtggccacagaagagtacggcgtg1740[0506]gtggccactaacctgcaatcggcaaacaccgctcctcaaacagggaccgtcaacagtcaa1800[0507]ggagccttacctggcatggtctggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcctatctgg1860[0508]gccaagattcctcacacggacggaaactttcatccctcgccgctgatgggaggctttgga1920[0509]ctgaaacacccgcctcctcagatcctgattaagaatacacctgttcccgcgaatcctcca1980[0510]actaccttcagtccagctaagtttgcgtcgttcatcacgcagtacagcaccggacaggtc2040[0511]agcgtggaaattgaatgggagctgcagaaagaaaacagcaaacgctggaacccagagatt2100[0512]caatacacttccaactacaacaaatctacaaatgtggactttgctgttgacacagaaggc2160[0513]gtttattctgagcctcgccccatcggcacccgttacctcacccgtaatctg2211[0517]<213>腺伴随病毒[0521]<223>/替换="Ser"[0525]<223>/替换="Arg"[0529]<223>/替换="Asn"[0531]<221>misc_feature[0533]<223>/注意="序列中给出的变体残基相对于变体位置的注解中的那些残基没有偏爱"[0535]MetAlaAlaAspGlyTyrLeuProAspTrpLeuGluAspAsnLeuSer[0537]GluGlyIleArgGluTrpTrpAspLeuLysProGlyAlaProLysPro[0539]LysAlaAsnGlnGlnLysGlnAspAspGlyArgGlyLeuValLeuPro[0541]GlyTyrLysTyrLeuGlyProPheAsnGlyLeuAspLysGlyGluPro[0543]ValAsnAlaAlaAspAlaAlaAlaLeuGluHisAspLysAlaTyrAsp[0545]GlnGlnLeuLysAlaGlyAspAsnProTyrLeuArgTyrAsnHisAlaAspAlaGluPheGlnGluArgLeuGlnGluAspThrSerPheGlyGlyAsnLeuGlyArgAlaVa