CN115112881B 一种免疫磁珠及其制备方法与应用 （扬州大学）

202210339643.32022.04.01CCTCCNO:C20211742021.07.08本发明公开了一种免疫磁珠及其制备方法高效的检出单核细胞增生李特菌，具有特异性2磁珠共价偶联制得，ActA单克隆抗体3G11由杂交瘤细胞株3G11或其传代细胞株分泌得到，杂交瘤细胞株3G11于2021年7月8日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC保藏编号为6.权利要求1所述的免疫磁珠或权利要求5所述的试剂盒在制备检测单核细胞增生李3血清学方法是检测李斯特菌病的重要依据之一，该方法能够利用已知的细菌或者细菌抗[0004]传统的细菌分离培养是检测单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，[0006]本发明还要解决的技术问题是提供了由杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌得到在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试剂盒[0009]本发明的还要解决的技术问题是提供了检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA[0010]本发明还要解决的技术问题是提供了用于检测单核细胞增生李斯特菌的免疫磁4珠及其制备方法和应用。[0011]本发明最后要解决的技术问题是提供了含有该免疫磁珠或免疫磁珠制成的试剂株分泌得到。[0023]本发明内容还包括一种检测单核细胞增生李斯特菌的竞争ELISA检测试剂盒，其[0026]本发明内容还包括检测单核细胞增生李斯特菌中应用的竞争ELISA检测方法，包[0028](2)稀释液稀释后的单核细胞增生李斯特菌阳性和阴性血清加至步骤(1)的抗原[0036]本发明内容还包括一种荧光标记单核细胞增生李斯特菌的间接ELISA方法，包括5[0040](4)于(3)中每孔加入400μL，稀释液稀释后的GoatAnti-MouseIgG(Alexa[0060]本发明内容还包括所述的免疫磁珠在制备检测单核细胞增生李斯特菌试剂或试6体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗[0063]本发明的基于免疫磁珠技术快速捕获并富集Lm，在多个方面具有较高的应用价[0066](2)本发明所述的竞争ELISA检测方法可以对单核细胞增生李斯特菌感染的所有然抗原亲和力较强的优势。基于此抗体建立的单核细胞增生李斯特菌免疫磁珠检测方法，[0068](4)本发明检测方法特异性强，且针对纯培养物中Lm的检测灵敏度达到102-7[0087]单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、鼠伤寒沙门菌(Salmonellatyphimurium)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichia[0092]具体免疫步骤如下：以纯化的His标签的ActA蛋白即rHis-ActA蛋白免疫8周龄雌8物rHis-ActA。bindingbuffer、washingbuffer、elutebuffer均为His-Bind[0095]具体步骤如下：按生物安全方法处死实施例1中加强免疫后第3天的免疫鼠，用75％酒精浸泡消毒5min，无菌取脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0在PEG(MW1450)作用下融合，用ICR小鼠(购自扬州大学比较医学中心)腹腔巨噬细胞作为饲养细℃诱导5h，离心收集菌体，以无菌PBS洗涤、悬浮。在冰浴中利用超声波破碎仪裂解菌体9[0102]采用有限稀释法对筛选到的阳性细胞克隆3G11进行连续3次的亚克隆并进行保即可采集腹水。将收集的腹水室温离心去除沉淀，收集上清，置于-70℃保存。保藏号为C2021174的杂交瘤细胞株或其传代细胞株(对应杂交瘤细胞3G11)分泌产生的单克隆抗体[0107]在包被有检测抗原rGST-ActA的酶标板中加入用封闭液按1:1000、1:2000、1:[0109]将制备的单克隆抗体3G11腹水使用ProteinG亲和层析方法进行纯化，将纯化后[0111]经鉴定，结果表明单克隆抗体3G11轻链可变区互补决定区1(CDR1)氨基酸序列如[0112]轻链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具体为：[0113]轻链可变区互补决定区3(CDR3)氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，具体为：[0115]重链可变区互补决定区2(CDR2)氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，具体为：[0130](4)向步骤(3)中每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:100的比例[0131](5)向步骤(4)中每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:200的比例[0132](6)向步骤(5)中每孔中加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:1000的[0133](7)向步骤(6)每孔加入400μL用含2-5％BSA的PBS溶液按照体积比1:10万的比例试验利用ActA单克隆抗体和羊抗鼠AlexaFluor488等对ActA进行可视化观察，发现肌动[0138]采用方阵滴定法，用包被液(pH9.6的0.05mol/L的碳酸盐缓冲液)将检测抗原后用洗涤液(pH7.2的PBST溶液)洗涤3次，每次5min；每孔加入300μL入50μL的反应终止液(2mol/L的H2SO4溶液)，用酶标仪读取在450nm波长处的吸光度值[0148]基于上述实验确定的最适条件(检测抗原浓度2ug/mL、酶标抗体稀释倍数为1:某羊养殖场)进表1部分血清样品尤登指数分析，计算每份羊血清的PI值。利用SPSS000.800.80001011110.130.8711[0157]按照实施例5建立的竞争ELISA方法，分别对大肠杆菌(E.coli)、肠炎沙门菌病原菌的阳性血清进行检测，同时设立阳性血清(Neggetivecontrol)及阴性血清计实验数据并分析CV值。结果如表4所示，该竞争ELISA方法不同操作者间的变异系数在M0.20.080.770.730.810.73[0177]按照实施例5建立的竞争ELISA方法，将包被有检测抗原的酶标板放置在37℃,分载体在37℃保存不同时间对检测结果的影响图，其中，Positivecontrol为阳性对照，[0179]按照实施例5建立的竞争ELISA方法，使用Candor公司的HRP-ProtectorTM对酶标照，Blankcontrol为空白对照，由图12可知，阴阳性对照和空白对照的变异系数均小于清样品(来源于江苏某疾控中心)进行检测。结果显示306份血清样品中ActA抗体水平均为珠悬液中缓慢加入活化试剂(每毫升中含碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)各5mgBSA)缓冲液，37℃封闭2h。最后磁分离弃上清，PBST洗涤3次后，重悬于PBST(pH为7[0193]分别取等量实施例12得到的活化后的羧基磁珠200μL，加入100μgActA单克隆抗定3个平行，共得到9组免疫磁珠。分别将9组免疫磁珠加入到103CFU/mL的Lm菌液(浓度为[0196]结果如图14所示，图14为抗体不同偶联时间对捕获效果的影响图，其中Colony[0199]结果如图15所示，图15为抗体不同添加量对捕获效果的影响图，其中Colony[0202]结果如图16所示，图16为菌液不同富集时间对捕获效果的影响图，其中Colony[0209]由表6可知，将最优条件下制备的免疫磁珠加入到上述五种不同属的菌株混合液疫磁珠并涂布李斯特菌显色培养基，37℃培养18-24h，观察平板上菌落生长状况，采用[0219]用建立的免疫磁珠方法检测20份市售鸡肉样品：每份样品均加入25mL无菌PBS溶18-24h，观察平板上菌落生长状况，并与传统微生物培养法的实验结果相比较(将另外法与传统微生物培养法两种方法共阳性加上两种方法共阴性的份数除以总份数，再乘以[0220]表8免疫磁珠与传统微生物培养法的符合率试验(Table8Testresultsofcoincidenceratebetweenimmunomagneticbeadandtraditionalmicrobial份样品为阴性，免疫磁珠方法样品阳性率为35.0％。传统微生物培养法检测结果8[0118]gagaagttcaagg[0119]cagctcagcagcct