实验十二常用血细胞化学染色

实验十二常用血细胞化学染色

Cytochemistrystainforbloodcells

一、过氧化物酶染苗

染色原理

粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶（myeloperoxidase,

POX或MPO）,能将底物H2O2分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基

联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕色的四甲基苯酿二胺，后

者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝色颗粒，沉淀于细胞

质内酶所在的部位。

试剂器材

1.l%TMB（3,5,31,5f—四甲基联苯胶）乙醇溶液:0.1gTMB溶于100mL88%

乙醉溶液中，置棕色瓶内，冰箱保存。

2.亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸储水中加入亚硝基铁氟晶体，至不

再溶解为止，置棕色瓶内，冰箱保存。

3.1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。

4.稀过氧化氢溶液滴,加10mL蒸储水稀释（新鲜配制）。

5.瑞氏（Wright）染色液。

6.新鲜涂片（骨髓或血片）、染色架、洗耳球、光学显微镜等。

操作步骤

1.取0.1%TMB乙酎溶液1mL,加亚硝基铁新化钠饱和溶液10口L,溶液

呈淡棕黄色，染色液应临用前配制。

2.在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁氟化钠饱和

溶液0.5mL,放置Imin,再加稀H2O2溶液0.7mL,吹匀,染色6min。

3.自来水冲洗,待干，用瑞氏染液复染15~20min,

4.自来水冲洗，待干，用油镜镜检。

注意事顶

1.血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。

2.TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染色效果较好，勿用90%〜95%乙醇,

否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染色效果差。

3.H2O2需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见

阳性颗粒，红细胞呈棕色或绿色，即表示H2（h过浓。若H2O2加于血片上不

产生气泡，则示无效。

4.染色液pH应为5.5。

5.试剂应置于低温限处，防止因光线照射而失效1：

实验评价

1.POX染色是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染色方法，临

床上不管是哪种急性白血病，首先做POX染色，以区分是急性髓细胞白血

病还是急性淋巴细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为

急单、急粒中如以小型原粒细胞为生者极易误认为急淋等.在判读细胞POX

染色结果前，要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染色是否成功。

2.POX阳性说明是急性髓细胞白血病（阳性较强常见于急性粒细胞白血病，

弱阳性常见于急性单核细胞白血病）；阴性说明各种急性白血病的可能性均

有。因原始细胞多表现为阴性反应，故本法对白血病的分型有一定的局限性,

特别是对某些分化极差的白血病，可能失去鉴别意义。

3.四甲基联苯胺法操作简单，染色效果较好，试剂尢致癌作用，但对染液

pH要求较高，如pH<5.0会导致假阳性结果。

二、氯乙酸AS・D荼盼醋酶染色

染色原理

血细胞内的氯乙酸AS-D荼酚酯酶(naphytholAS-Dchloroacctatcesterase,

NAS-DCE)水解基质液中的氯乙酸AS-D茶酚，产生AS-D荼酚，进而与基

质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内的所在的部

位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC,形成的有色沉淀为红色。

试剂器材

1.10%甲醛甲醇固定液

甲醛25mL

甲醇75mL

混合后置4c冰箱保存。

2.Veronal醋酸缓冲液

甲液：

醋酸钠(含3H20)1.94g

巴比妥钠2.94g

蒸储水100mL

乙液：

O.lmol/L盐酸取盐酸(比密1.190g/L)0.85mL加蒸储水至100mL。

取甲液50mL,乙液45mL,再加蒸储水135mL,用Imol/L盐酸调pH

至7.5~7.6。

3.基质液

氯乙酸AS-D茶酚1OOmg

丙酮0.5mL

蒸储水5mL

Veronal醋酸缓冲液5mL

固酱紫GBC盐10mg

不必过滤立即染色，一次用完。

4.苏木素染液。

操作步骤

I.固定新鲜干燥的涂片在固定液中30s~lmin,蒸储水冲洗，待干。

2.显示放入基质液(37℃)30min,自来水冲洗。

3.复染苏木素染液复染5mn,自来水冲洗，待干，镜检。

注意事顶

1.冬季室温低，茶酚和固酱紫GBC盐不易溶解，可放37℃温箱促溶。

2.茶酚在丙酮中溶解后再加其他液体。

3.NAS-DCE不被氟化钠抑制。

4.此酶染色后的标本易脱色,不能长期保存°

实验评价

NAS-DCE阳性反应几乎•仅出现在粒细胞、较POX染色更具有特异性，因此

又称为“粒细胞酯酶"、”特异性酯酶”。故该酶较特异地识别粒细胞系，有助

于急粒和急单的鉴别，特别是对某些POX反应较强的单核细胞白血病鉴别

意义更大。

三、a一醋酸荼盼醋悔染色

染色原理

血细胞内的a-醋酸荼酚酯酶(a-n叩hylhyolacetateesterase,a-NAE)在pH中

性的条件下可水解基质液中的a-醋酸荼酚，释放出a-荼酚与基质液中的重

氮盐偶联形成不溶的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用

的重氮盐对坚牢蓝B,形成的有色沉淀为棕黑色或灰黑色。a-NAE存在于

单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。单核系细

胞的阳性可被氟化钠抑制，所以做a-NAE染色时.通常同时做氟化钠抑制

试验。

试剂器材

1.0.067mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)。

甲液：NazHPCh-12H2O2.388g力口蒸馆水至100mL。

乙液：KH2po40.908g加蒸储水至100mL。

取甲液87mL,乙液13mL混合，调pH至7.6。

2.基质液0.067mol/L磷酸缓冲液50mL,力口10g/La-醋酸茶酚(用50%丙酮

为溶剂)1.0mL,充分振荡，直至最初产生的混浊物(大部分)消失为止，加重

氮盐(坚牢蓝B等)50mg,振荡，过滤后立即使用。

3.10g/L甲绿水溶液。

操作步骤

1.固定新鲜干燥涂片置10%甲醛生理盐水中5min,自来水冲洗5min,

待干。

2.显示放入基质液(37℃)lh,自来水冲洗。

3.复染108人甲绿水溶液复染5~15］】1而，自来水充分冲洗，待干，镜检。

4.氟化钠抑制试验在1mL基质液中加入1.5mg氟化钠，其余按本染色法

进行，染色步骤同上:

注意事顶

I.标本必须新鲜，应于取材后两天内染色。

2.重氮盐的选择依次为坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B的染色效果为好。

实验评价

1.a-NAE染色是一种非特异性醋陋染色，是判断急性白血病的常规染色

方法，在中性pH时用a-NAE作底物，正常单核细胞和原始单核及幼稚单

核细胞均呈阳性反应，不被氨化钠抑制；其他血细胞则呈阴性或弱阳性反应,

故a-NAE又称"单核细胞酶”，结合氟化钠抑制试验，对鉴别单核细胞白血

病有重要价值。

2.有时单系细胞或粒系细胞、淋系细胞阳性较弱，因此难以判断加氟化钠

后的抑制情况，且有时阳性细胞是由于假阳性所致。

四、过碘酸•雪夫染色

染色原理

过碘酸是氧化剂,便含有乙二醇基(-CHOH-CHQH)的多糖类物质(糖原、黏

多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪

夫试剂中的无色品红结合，使其变成紫红色，定位于细胞内的多糖所在处。

在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再糖原染色，可

鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其他

多糖类物质。过碘酸-雪夫反应(periodicacid-Schiffreaction,PAS),以前又称为

糖原染色。

试剂器材

1.IOg/L高碘酸溶液

HIO4-2H2O1g

蒸镭水加至100mL

2.雪夫染液取蒸储水200mL加人500mL容量的三角烧瓶，加热至沸。移

开火焰，缓慢加入碱性品红1g,继续加热2min,使之充分溶解后停止加热。

冷却至60℃左右时,过滤，加入Imol/L盐酸20mL,混匀。待冷却至25c

加入偏重亚硫酸钠(Na2s205)2g混匀，置带塞的棕色玻璃瓶中，放暗处24h

后加活性炭1g,振荡混匀吸附色素，用滤纸过滤后密封在棕色瓶内，放冰

箱保存。

3.亚硫酸液

IOOg/L偏重亚硫酸钠6mL

1moI/L盐酸5mL

蒸储水100mL

每次用前新鲜配制。

4.20g/L甲绿

甲绿2g

蒸储水力口至100mL

5.淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液，收集唾液离心耳又上清液，内含淀粉酶，

将麦芽糖淀粉酶0.1-l.Og溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)100mL中。

操作步骤

I.固定新鲜干燥的涂片用95%乙醇固定10min,蒸镭水冲洗，待干。

2.如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60min,然后用

蒸储水冲洗。

3.10g/L高碘酸氧化15~20min,蒸储水冲洗，待干。

4.置雪夫染液中室温染色30~60min。

5.用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗2〜3min,待干。

6.20g/L甲绿复染10-20min。

7.水洗，待干，镜检。

注意事顶

I.所用染色缸及器具应十分清洁、手燥。

2.固定试剂不同，染色效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲

醛蒸气，其中乙醇固定后糖原颗粒明显，各成熟粒细胞的反应有较明显的颜

色差异，易于判断阳性反应的程度，且唾液消化后的对照标本没有假阳性，

故通常选用乙醇为固定剂。

3.10g/L高碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用，氧化时间要准确，否则

将导致假阳性或假阴性。

4.碱性品纣试剂对染色的影响不同品牌的碱性品纤染色效果不一,碱性品

红的质量是试验成败的关键因素之一。雪夫(Schi①染液应避光保存，无色,

变红则失效。

5.染色后标本应及早观察和记录，染色后标本保存8天后，将逐渐褪色，

保存时间延长，褪色更为明显。

实验评价

I.小同疾病血细胞的PAS染色呈小同程度的阳性反应，它在诊断恶性红细

胞系疾病中最有价值(尤其是强阳性)；但要注意的是恶性红细胞系疾病并不

都是阳性，良性红细胞系疾病也并不是全为阴性。

2.PAS染色在鉴别急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病中作用不大，

而在诊断淋巴细胞白血病、鉴别脂质代谢障碍等疾病有一定价值。

五、中性粒细胞碱性磷酸酶染色

染色原理

中性粒细胞碱性磷酸酶染色的方法有Gomori钙-钻法和k叩low偶氮偶联法,

因为钙-钻法操作较为繁琐且所需时间长，偶氮偶联法的试剂盒操作方便，

染色时间短，故目前国内常用偶氮偶联法，下面介绍该方法的原理。

kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilicalkaline

phosphatase,NAP)在pH9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸荼钠

底物，释放出荼酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有色沉淀，定位于细

胞质酶活性所在之处,

试剂器材

1.10%甲醛甲醇固定液

甲醛25mL

甲醛75mL

混合后置4c冰箱保存。

2.丙二醉缓冲液

(1)贮备液(0.2mol/L)

2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇10.5g

蒸储水加至500mL

溶解后保存冰箱内，

(2)应用液(0.05mol/L,pH9.75)

0.2mol/L贮存液25mL

O.lmol/L盐酸5mL

蒸储水加至100rnL

3.基质孵育液(pH9.5〜9.6)a-磷酸荼酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓

冲液20mL,再加坚牢紫酱GBC盐(或重氮坚牢蓝)20mg混合后用滤纸过滤,

用前临时配制。

4.Ig/L苏术素复染液取1g苏木素加到蒸储水500mL中，加热煮沸，使

苏木素溶解，再加入素储水500mL、碘酸钠200mg、硫酸铝钾50g,充分混

匀，置棕色玻璃瓶中室温保存，使用前过滤。

操作步骤

I.固定新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s,蒸储水轻轻冲洗

30~60s,待干。

2.显示把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10~15min(冬季放孵育

箱温育)c蒸储水冲洗2miru

3.复染置苏木素复染液复染5〜8min,蒸饰水冲洗1〜2min,待干，镜检。

注意事顶

1.坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是NAP染色成败的关键。

2.基质孵育液必须临用前新鲜配制。

3.所用的片子要新鲜。固定后，一般在一周内进行染色。做NAP染色时，

最好选择其他患者的片子做阳性对照。

4.NAP染色以阳性率及积分报告结果。

实验评价

1.本法较钙-钻法简便、快速，色彩鲜艳，结果准确。

2.临床上NAP染色应用较广泛，但受主观因素影晌较大，因此参考值变化

较大。所以,NAP积分明显增高或明显减低者才有临床意义，同时要排除生

理性影响（如年龄、性别、应激状态、月经周期、妊娠及分娩等）。

六、铁染色

染色原理

正常［骨髓中的贮存铁主要存在于骨髓小粒和幼红细胞中。骨髓中的铁在酸

性环境下与亚铁氟化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁轨化铁沉淀，定位于含

铁的部位。

试剂器材

1.酸性亚铁氟化钾溶液

200g/L亚铁氟化用溶液5份

浓盐酸1份

取200g/L亚铁银化钾溶液置于试