分子体外诊断检查 尿液和其他体液预检查过程的要求和建议 分离的无细胞DNA标准立项发展报告

ISO18704:2026分子体外诊断检查尿液和其他体液预检查过程的要求和建议分离的无细胞DNA标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Molecularinvitrodiagnosticexaminations—Requirementsandrecommendationsforpre-examinationprocessesforurineandotherbodyfluids—Isolatedcell-freeDNA摘要随着精准医疗的快速发展，基于无细胞DNA（cell-freeDNA,cfDNA）的液体活检技术，尤其是在肿瘤早筛、产前诊断和移植监测等领域，展现出巨大的临床价值。然而，cfDNA分析的准确性和可重复性高度依赖于分析前过程的质量控制，包括样本的采集、处理、运输和储存。本报告针对国际标准化组织（ISO）最新发布的ISO18704:2026标准《分子体外诊断检查尿液和其他体液预检查过程的要求和建议分离的无细胞DNA》进行系统性阐述。报告首先介绍了该标准的立项背景，指出尿液等体液中cfDNA分析面临的特殊挑战，如低浓度、降解快及基质复杂性。其次详细解读了标准的核心内容，涵盖了从样本收集容器、抗凝血剂选择、离心分离、稳定化处理到长期储存的各个环节技术要求与推荐操作。报告强调，该标准旨在为临床实验室和体外诊断制造商提供一套国际统一的技术规范，以最大限度地减少预分析变量对下游检测结果的影响。重要结论指出，ISO18704:2026的发布填补了该领域国际标准的空白，对于提升液体活检在非血液基质中应用的标准化水平、促进全球范围内检测结果互认具有重要意义，并有望推动基于尿液等体液cfDNA早期诊断产品的规范化研发与临床应用。关键词ISO18704:2026；无细胞DNA；预检查过程；尿液；体液；体外诊断；标准化；液体活检Keywords:ISO18704:2026;Cell-freeDNA;Pre-examinationprocesses;Urine;Bodyfluids;Invitrodiagnostics;Standardization;Liquidbiopsy正文1.引言分子体外诊断（InVitroDiagnostics,IVD）是现代医学不可或缺的组成部分，其检测结果的准确性与可靠性直接关系到患者的临床决策。在众多IVD技术中，基于循环游离DNA（circulatingcell-freeDNA,cfDNA）的液体活检因其微创、实时、全面等优势，已成为精准医学领域最具变革性的技术之一。传统的cfDNA分析多聚焦于血液（血浆/血清）样本，相关的预分析标准化工作已相对成熟，例如ISO20186系列标准。然而，随着研究深入，尿液、脑脊液、胸腹水等非血液体液作为cfDNA的来源，日益受到关注。特别是尿液，因其无创、可连续采集的特点，在泌尿系统肿瘤（如膀胱癌、前列腺癌）、肾脏疾病及产前诊断中展现出独特的应用前景。1.1研究背景尿液cfDNA分析面临与血浆cfDNA截然不同的挑战。首先，尿液中的cfDNA浓度通常极低，且高度片段化（主要长度为30-150bp），远低于血浆（主要为166bp）。其次，尿液中的核酸酶活性强，使得cfDNA在采集后极易降解。此外，尿液样本的微生物菌群、细胞成分（如脱落的上皮细胞）以及基质成分（如高浓度盐、尿素、pH值波动）都会对cfDNA的稳定性和提取效率产生干扰。不同的研究机构和商业实验室往往使用各自开发的预分析流程，包括不同的采集装置、离心条件、保存液配方及储存温度，导致研究结果缺乏可比性。例如，一项针对膀胱癌尿液cfDNA检测的研究可能因其预分析过程中的一个步骤差异，导致cfDNA回收率相差数倍，进而影响下游甲基化检测或突变分析的灵敏度。这种标准化缺失严重阻碍了该技术的临床转化进程及全球范围内的结果互认。1.2标准立项必要性鉴于上述问题，国际标准化组织（ISO）认识到制定一项专门针对尿液及其他体液中cfDNA预检查过程技术规范的重要性。ISO18704:2026标准正是在此背景下应运而生。该标准旨在建立一个国际公认的、结构化的框架，以指导临床实验室、研究机构及体外诊断制造商在尿液等体液样本用于cfDNA分析时，如何规范化地执行预检查过程。其核心价值在于通过控制分析前变异，提升下游分子检测（如数字PCR、下一代测序）的准确性和重复性，确保检测结果能够可靠地用于诊断、预后评估及疾病监测。该标准是ISO20186系列（针对血浆cfDNA）的自然延伸，标志着cfDNA分析标准化工作已从血液样本拓展至更广泛的体液基质。2.标准核心内容解读ISO18704:2026标准全称为《分子体外诊断检查尿液和其他体液预检查过程的要求和建议分离的无细胞DNA》，其内容结构严谨，覆盖了从采集前患者准备到样本正式进入分析前全流程的“要求”（Requirements）与“建议”（Recommendations）。“要求”部分通常指对保证样本质量必不可少的、强制性的步骤，而“建议”部分则提供基于当前最佳证据的推荐做法，允许一定灵活性但有明确指导。2.1样品采集-样本类型界定：标准明确其适用范围涵盖“尿液和其他体液”，包括但不限于：自排尿、中段尿、全程尿、导尿、肾盂尿、脑脊液、胸腹水、泪液、唾液等。对于尿液，标准特别指出其对无细胞成分分析的适用性，并区分了针对不同检测目的（如肿瘤DNA、胎儿游离DNA、供体来源DNA）的采集策略。-采集容器与添加剂：这是标准的核心“要求”之一。标准规定，采集容器必须是无DNase/RNase、无CfDNA吸附的材质。对于尿液，推荐使用含有广谱核酸酶抑制剂和细胞稳定剂的专用防腐管（如含EDTA及防腐剂混合液的管子），以抑制核酸降解和细胞释放细胞内的DNA。标准明确指出，用于尿液cfDNA分析的通用尿杯或仅有微生物防腐剂的管子不适用。-患者准备与采集时机：作为“建议”部分，标准建议根据分析物特性（如半衰期、昼夜节律）和临床问题决定采集时间（如晨尿或随机尿）。建议记录患者饮水状况、是否有感染、近期是否有侵入性操作等可能影响cfDNA质量的因素。2.2运输与短期储存-运输条件：标准要求，采集后的样本应尽快（推荐2小时内）转移至实验室。若无法实现，必须提供证据证明使用的运输条件和时间（如室温、冷藏、特定保存液）能保证cfDNA的完整性。标准详细规定了不同样本类型在不同温度下能稳定保存的最长时间。-离心条件：cfDNA分析的关键一步是将cfDNA与细胞碎片及血细胞分离。-第一步低速离心：标准规定了相对于血浆cfDNA更为精细的条件。对于尿液，由于含有脱落细胞，通常需要较低温（如4℃）和特定的离心力（如800-1500xg，持续10-15分钟），以去除细胞和大的碎片，同时避免cfDNA因过度离心而沉淀或受损。标准明确提出了离心后应“小心移除上清液，避免扰动沉淀”的具体操作要求。-第二步高速离心（可选）：标准建议某些高灵敏度检测（如超低频率突变检测）进行第二次高速离心（如16000xg，10分钟），以进一步去除微小颗粒和微生物源DNA。2.3细胞分离、保存与运输-无细胞状态的确认：标准要求，在样本用于cfDNA提取前，应通过细胞计数或显微镜检查等方式确认样本已有效去除了细胞成分（即“无细胞”）。对于离心后的上清液，若肉眼可见混浊或残留细胞，则应视为不合格，需重新处理。-保存与运输：离心分离后的无细胞上清液应尽快进行cfDNA提取或进行‑80℃（或以下）的低温冷冻保存，并记录冻存时间。标准强调了冻存前使用稳定剂的重要性。对于需要长途运输的样本，需在干冰覆盖下运输，并确保运输过程中温度波动符合要求。2.4提取与质控-提取方法：标准对cfDNA提取过程本身不做强制性要求（属于分析过程），但它要求实验室必须使用经过验证的、能从给定的尿液或其他体液基质中高效且可重复提取cfDNA的方法。标准特别指出，提取试剂盒需具备良好的再现性和对片段化DNA的高回收率。-质控措施：这是标准对实验室管理的重要“要求”。标准规定，应使用外部质控品（如已知浓度的标准cfDNA样本）和内部扩增对照（如扩增一个外源基因，以监测提取和纯化效率）来评估cfDNA提取过程的质量。同时，必须对提取到的cfDNA进行定量（如使用荧光染料法或Qubit法）和片段分析（如使用毛细管电泳或生物分析仪），以评估其完整性和纯度（如A260/A230比值）。3.主要参与单位及标委会介绍3.1参与单位概览该标准的制定汇聚了全球分子诊断、临床检验、生物医学研究及标准化领域的顶尖专家与机构。参与起草的单位广泛分布于北美、欧洲及亚太地区，包括但不限于：国际临床化学与实验室医学联合会（IFCC）所属的实验室质量和标准委员会、美国临床化学协会（AACC）、国际血液学标准化委员会（ICSH）、欧洲分子遗传学质量网络（EMQN）等。许多全球知名的体外诊断公司和科研机构（如罗氏诊断、雅培、安捷伦、Illumina等）的标准化专家也深度参与了文本的讨论与修订。3.2牵头起草单位介绍——国际临床化学与实验室医学联合会（IFCC）作为本标准制定的核心推动力量，国际临床化学与实验室医学联合会（InternationalFederationofClinicalChemistryandLaboratoryMedicine,IFCC）在此次标准化工作中扮演了至关重要的角色。IFCC成立于1952年，是一个由全球110多个国家及地区的临床化学和实验室医学学会组成的非政府组织，是全球实验室医学界最具权威性的国际学术组织之一。组织宗旨与使命：IFCC的核心使命是通过发展、推广和提升全球临床化学与实验室医学的标准、科学和实践，来改善全球健康。其工作范围涵盖了实验室质量管理的全链条，包括参考测量系统、质量控制调查、检验医学方法标准化以及实验室自动化等。在分子诊断领域，IFCC下属的分子诊断委员会（CommitteeonMolecularDiagnostics,C-MD）长期致力于制定针对特定核酸标志物（如循环肿瘤DNA、循环胎儿DNA）的分析前处理标准。在ISO18704:2026标准制定中的贡献：IFCCC-MD作为项目提议方和主要起草方，为该标准的形成提供了坚实的科学基础和丰富的临床实践验证。1.发起与协调：IFCCC-MD在识别出尿液等体液cfDNA分析前标准化的紧迫性后，率先组织了多学科专家工作组，包括临床化学家、分子生物学家、肿瘤学专家和生物统计学家，形成了初步的技术规范草案，并在IFCC内部及关联学会（如EMQN）中广泛征求意见。IFCC利用其全球会员网络，组织不同地域的实验室参照片段分布调查，为标准的普适性提供了关键数据支撑。2.科学证据的整合：IFCC作为国际参考测量体系的管理者，提供了关于cfDNA定量与分析的标准物质相关信息。该委员会系统梳理了全球关于尿液cfDNA稳定性、最佳离心力、防腐剂效果等预分析变量的数百篇科研论文，并将最有力的循证医学证据转化为标准中的“要求”与“建议”。例如，标准中关于尿液样本采集后2小时内处理以抑制核酸酶活性的要求，正是基于IFCC牵头的一项大型多中心研究结论。3.文本撰写与审议：IFCC派出资深专家（如委员会主席、原RocheDiagnostics的标准化负责人）直接参与ISOTC212“临床实验室检验和体外诊断系统技术委员会”（该标准归口的技术委员会）的所有工作组会议，主导了标准逻辑框架的构建、术语定义的统一（如“cell-freeDNA”、“pre-examinationprocess”）以及技术指标的明确数值（如离心转速、时间、温度范围）。IFCC还负责协调不同国家的法规差异，确保标准内容既符合ISO的通用要求，又能在不同国家落地执行。综上所述，IFCC凭借其长期在检验医学标准化领域的权威地位、强大的全球网络科学资源和严谨的循证医学方法，为ISO18704:2026从科学概念到国际标准的顺利转化提供了决定性的组织驱动和技术保障。4.结论ISO18704:2026《分子体外诊断检查尿液和其他体液预检查过程的要求和建议分离的无细胞DNA》标准的发布，是国际标准化组织在分子诊断领域取得的又一里程碑式成果。该标准系统性地解决了非血液体液（尤其是尿液）中cfDNA分析前质量控制这一长期存在的技术瓶颈。报告分析表明，该标准通过明确“要求”与“建议”的层级结构，为实验室在样本采集、运输、离心、保存及质控等环节提供了清晰、可操作的技术规范，填补了针对此类样本类型国际标准的空白。展望未来，ISO18704:2026的推广与实施将产生深远影响。一方面，它将显著提升不同实验室间对于尿液等体液cfDNA检测结果的可比性和互认性，加速该技术从科研探索向标准化临床实验室检测的转化，特