【活性小分子化合物作用靶点鉴定方法的研究进展的文献综述9400字】

活性小分子化合物作用靶点鉴定方法的研究进展的文献综述活性小分子化合物作用靶点的鉴定和验证是化学生物学领域的重要一步。尽管蛋白质组学和基因组技术的最新进展加快了这种鉴定过程，但发现小分子作用靶点仍然是最具挑战的一步。为了克服靶点识别的困难，已经开发了基于基因组学，蛋白质组学和生物信息学领域衍生的新技术。迄今为止，用小分子亲和探针进行经典的亲和纯化并随后进行质谱分析仍然是最常见和最成功的方法。在过去的30年中，天然产物已成为治疗各种疾病新药的重要来源[65,66]。与化学合成药物相比，天然产物及衍生物在结构新颖性，生物相容性和功能多样性方面具有显著优[67]。据统计，在1939年至2016年间获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物中，有超过50%的药物来自天然产物，这些化合物是俗称天然药物[68]。例如Elliptinium，一种天然存在的植物生物碱，已被开发为抗癌天然药物Celiptium，广泛用于乳腺癌和肾细胞癌等多种癌症治疗[69,70]。Retapamulin是另一种天然药物，它是提取自侧耳菌（Pleurotusmutilus）Pleuromutilin化合物的衍生物，已被批准为新型抗菌药物[73]。除了已开发为上市药物的天然产物外，还有许多已成为临床药物的候选化合物，例如白藜芦醇、姜黄素、冬凌草甲素等[72-82]。然而，基于天然产物和随机结构修饰开发新药是一个漫长而昂贵的过程，部分原因是难以全面了解其作用靶点和分子机制[83,84]。在后基因组时代，化学遗传学已成为将遗传编码信息转化为生物学功能的重要方法，加速了临床疾病治疗的发展。此外，基于表型的药物发现或正向化学遗传学的重要性得到充分验证（Fig.1.3）。在1999年至2008年之间批准的75种“first-in-class”药物中，基于表型筛选的药物有28种，基于靶点筛选的药物仅17种[85]。然而，鉴定具有生物活性小分子化合物的作用靶点仍然具有挑战性：（i）小分子化合物可能靶向一种以上的蛋白质；（ii）小分子化合物还可以靶向生物分子，例如DNA，RNA，脂质，甚至金属离子；（iii）小分子与其靶标之间相互作用的方式和强度范围很广；（iv）小分子可以在细胞或体内代谢，某些化合物可能会转化为活性形式、非活性形式或不同作用模式的形式[86]。Fig1.3Comparisonoftarget-baseddrugdiscoveryandphenotype-baseddrugdiscovery[87].鉴定活性小分子化合物的作用靶点的方法大致可分为四类：（i）基于亲和力发展的化学蛋白质组学；（ii）基于表型的方法比较小分子化合物和已知参考药物的生物学特性；（iii）基于遗传的方法确定小分子化合物耐受或敏感基因；（iv）计算模拟策略，基于化学相似性在计算机上预测药物靶标[98-91]。其中，基于亲和力发展的化学蛋白质组学是最常见的方法。随着质谱（MS）的发展，目前已经提高了目标蛋白检测的灵敏度，并使亲和纯化与定量蛋白质组学相结合使用。此外，开发了新的基于配体的蛋白质标记和基于蛋白质稳定性的方法。在这里，我们综述了基于亲和力的化学蛋白质组学靶点筛选方法的研究进展。1.1基于亲和力的化学蛋白质组学研究策略化学蛋白质组学是一种多学科方法，它将化学合成、细胞生物学和质谱相结合[92]。它为对特定药物或具有生物活性的天然产物的靶点进行全面分析，为靶点鉴定提供了一个直接且无偏见的研究策略。蛋白质组学通常为研究和解释药物的作用机制提供最可靠的数据。化学蛋白质组学可根据其不同的工作流程分为两类（Fig.1.4），即基于亲和性的化学蛋白组学（affinity-basedproteinprofiling，ABPP）和基于化合物为中心的化学蛋白质组学（compound-centricchemicalproteomics，CCCP）[93]。Fig.1.4.affinity-basedproteinprofilingandcompound-centricchemicalproteomicsCCCP是最早确定靶标蛋白的方法，该方法已经使用了数十年[94-97]。随着蛋白质组学技术的发展，CCCP将经典亲和层析方法与现代蛋白质组学融合在一起，以鉴定小分子化合物的作用靶点。小分子化合物通过化学偶联直接固定在树脂（例如琼脂糖珠）上，然后将复合物与细胞蛋白提取物共同孵育，然后进行多次洗涤以除去非特异性结合的蛋白质，结合的蛋白通过SDS分离，并通过蛋白质谱鉴定靶蛋白。该方法具有快速、大量富集靶标蛋白的优点，但对细胞材料、将小分子合成到树脂上的化学合成方法要求较高，现已较少使用。ABPP是一项结合了基于活性探针和蛋白质组学的技术，可识别生物活性小分子的蛋白靶标，以帮助阐明其作用机制和副作用[98,99]。在典型的ABPP实验中，首先根据小分子化合物的构效关系（SAR）研究进行设计和合成探针[100]。探针的合成应符合如下原则：（i）探针应保留其母体分子的药理活性，以确保后续靶点鉴定的准确性；（ii）探针应易于富集结合的蛋白质靶标。接下来，将探针与效应活细胞、裂解蛋白或组织匀浆一起孵育，使其完全结合靶蛋白。通过化学和生化技术富集后，采用蛋白质组学方法鉴定蛋白质靶标。最后，通过生物学实验技术验证靶点生以及相应的药理作用。如上所述，化学蛋白质组学方法具有许多优点，例如无偏见和允许在蛋白质组学水平上实现高通量筛选。但同时也存在一些问题[101-106]，第一：小分子化合物衍生化后必须保持与原型化合物同样的靶点识别特性，化合物的结构修饰通常需要耗时的构效关系研究来确定最佳的修饰位点。对于具有复杂结构或没有可修饰官能团（例如胺、羧基、羟基或巯基）的化合物，合理修饰会变的更加困难。第二：化合物与蛋白分子之间的非特异性相互作用。例如，白蛋白和血红蛋白对多种化合物具有亲和力，负责药物代谢的酶也可以结合多种化合物。此外，蛋白质可能会与琼脂本身结合，也可能与其他基团（例如接头）结合。第三：在多数情况下，全细胞裂解液被用作靶蛋白样品，由于细胞裂解液中的盐和去污剂可能会影响蛋白质与化合物的相互作用，导致实验出现阴性结果。第四：仪器检测的规模或灵敏度较低，使得检测化合物靶点为低丰度蛋白时变得更加困难。1.2基于小分子亲和性的标记技术设计和合成小分子亲和探针是靶点鉴定的第一步和关键步骤。通常，探针由三个部分组成，分别负责其各自的功能：（i）反应基团，其衍生自母体药物分子并确保保留其药理活性以及结合或修饰蛋白质靶标的能力；（ii）用于靶标富集或检测的报告基团标签，例如生物素，炔烃或荧光基团；（iii）连接链接，用于连接反应基团和报告基团，并且连接子的长度应足够长以避免空间位阻[107,108]。Fig1.5Affinitypurificationusingsmall-moleculeaffinityprobes.(A)Immobilizedprobe.(B)Activity-basedprobe.(C)Clickchemistryprobe.(D)Photoaffinityprobe.1.2.1基于化合物中心的固定化探针以化合物中心的固定化探针技术是鉴定生物活性小分子靶蛋白的经典方法。基质具有高度亲水性，可减少非特异性蛋白质结合，琼脂糖珠通常用作基质材料，要将小分子连接到琼脂糖珠表面，首先需要进行构效关系研究以确定小分子上适当的接头位置。聚乙二醇（PEG）被认为是最理想的接头，因为它在水溶液中的溶解度高且非特异性结合低[109]。在Pulldown实验中，琼脂糖珠上PEG连接的小分子很容易暴露于细胞裂解物。使用珠上亲和方法，KL001的作用靶点通过Pulldown实验和质谱法确定为cryptochrome蛋白（CRY）[110]。从基于表型细胞的筛选中，BRD0476被鉴定一种胰腺β细胞凋亡抑制剂，用同位素标记细胞裂（SILAC）进行Pulldown，然后进行质谱分析显示，泛素特异性蛋白酶9x连锁（USP9X）是BRD0476的作用靶点[111]。通过对三嗪类化合物库进行筛选，以确定一种可以抑制斑马鱼胚胎眼睛发育的活性化合物，Pulldown和质谱法证实核糖体蛋白（S5、S13、S18和L28）为活性化合物encephalagen的作用靶点[112]。另外还有许多化合物的作用靶点，包括FK506、曲霉毒素、Oleocanthal、scalaridial、GymenemicacidI和Artemisinin等化合物（Fig.5b）也是通过基于化合物中心的固定化探针获得的作用靶点[95,113-117]。尽管基于化合物中心的固定化探针易于合成和广泛使用，但其局限性为固定材料引起的空间位阻仍未解决。在CCCP中使用的固定化探针可能会影响真实靶标与反应基团之间的结合，可能导致出现假阳性蛋白靶标或潜在重要蛋白质靶标的丢失。1.2.2基于活性的经典小分子探针为了克服固定化探针引起的化合物活性丧失，开发了基于活性的探针技术（ABP）用于化学蛋白质组学中的靶点鉴定。在设计此类探针时，要考虑的第一个因素是药物分子的活性，首先报告基团和连接链的结合不应影响活性分子的生物活性。因此，应该在合成探针之前研究活性分子的构效关系，并确定喝合成探针的药理活性。与固定探针不同，基于活性的小分子探针可以在富集之前与蛋白相互作用，甚至可以穿过细胞膜与活细胞中的靶蛋白结合，从而潜在地反映在细胞生理条件下药物与靶点的相互作用。然而，非固定化探针提出了一个明显的问题：如何富集检测与探针结合的靶蛋白？在基于活性的小分子探针的结构中，需要连接一个报告基团来解决这个问题。在各种报告基团中，生物素与链霉亲和素的亲和力非常强，因此可以利用生物素作为探针的报告基团。例如，为了阐明白藜芦醇的作用靶点和机制，将生物素标签连接到白藜芦醇上合成小分子探针，并通过体外生化实验验证了该探针的活性。随后，将该探针与肿瘤细胞裂解物一起孵育，然后采用链霉亲和素修饰的琼脂糖珠富集靶蛋白，证实白藜芦醇的靶蛋白为组蛋白脱乙酰基酶I（HDAC1），并揭示了局灶黏附激酶的表观遗传调控途径[118]。LeptomycinB、WithaferinA、Radicicol和Adenanthin等化合物通过基于基于活性的小分子探针获得了作用靶点[119-127]。除生物素标签外，荧光标签还广泛用作靶标识别。荧光修饰探针可以高效、快速地检测靶蛋白，但无法像生物素标签一样富集靶蛋白[128]。但是，在某些情况下，由于生物素的尺寸较大，生物素可能会干扰生物活性分子的原始活性。此外，蛋白质组中的内源性生物素化蛋白可通过产生假阳性靶蛋白来干扰鉴定结果[129,130]。1.2.3基于活性的点击化学探针随着生物正交反应的进展，特别是点击反应的发展，生物素化探针的局限性已大大减轻。在过去的十年中，在天然产物的结构中引入反应基团是最广泛的用于靶点鉴定的策略之一。在正交反应基团下，此类探针可以与其互补物（例如叠氮化物与炔烃，strainedalkene与tetrazine，tetrazine与环丙烷）进行生物正交点击反应[131-133]，从而将探针与亲和标签共价连接（生物素-叠氮化物，生物素-环丙烷等）用于随后的蛋白富集和靶点鉴定。由于它们的空间位阻相对较小，这些正交反应基团对天然产物的药理活性几乎没有影响，甚至没有影响，并且探针在点击反应和富集之前可以很容易地到达细胞内与靶蛋白相结合。许多课题组通过点击化学探针对天然产物进行作用靶点鉴定都取得了重大研究进展，其中化合物包括阿维西林、姜黄素、青蒿素，花姜酮和胆固醇[134-138]。以青蒿素为例，研究者利用青蒿素的点击化学探针鉴定其在恶性疟原虫中的蛋白质靶点，并获得了两个重要发现：（i）血红素主要负责青蒿素的活化；（ii）青蒿素可通过复杂的靶向机制杀死疟原虫。由于很难改变青蒿素的结构而不影响其活性，因此作者合成了一种来自青蒿素的点击化学探针并验证探针活性。将探针与疟原虫共同孵育，通过点击反应用生物素标签修饰靶标探针复合物，最终，鉴定出124种相关蛋白。Ferroptocide是从二萜类天然产物截短侧耳素化学衍生的小分子化合物，其可快速，有效的诱导癌细胞的铁死亡[139]。Llabani等通过生物学评估合成了一种Ferroptocide的点击化学探针，以鉴定其在细胞中的蛋白靶点。将细胞用20μM的Ferroptocide探针孵育30min，然后与生物素叠氮化物进行点击反应，并用链霉亲和素磁珠富集。质谱分析共得到300多个可能目标靶蛋白，在随后的CRISPR基因敲除研究中，发现Ferroptocide是硫氧还蛋白的抑制剂。1.2.4基于活性的光交联反应探针在药物化学和化学生物学中，光交联亲和标记方法是识别生物活性分子靶标的有效方法。探针设计分为三种功能基团：药效团、光亲和基团和连接体（Fig.1.5）[140,141]。如前所述，额外基团的添加会很容易地增加小分子的体积，这往往会降低这些化合物的活性。建议使用体积较小但功能齐全的标签，以避免产生较大的结构变化。利用铜催化的点击化学反应，通过生物正交反应对炔烃进行共价修饰，从而得到了广泛的应用。光亲和标记方法需要光亲和官能团和报告基团设计在单个分子中[142,143]。因此，活性化合物必须用小的光亲和基团（芳基叠氮化合物、苯甲酮和双吖吡啶）和报告基团进行修饰[144,145]。这种方法的优点是使用一个非常活泼的卡宾官能团，它是由紫外线照射产生的，并共价连接到特定的蛋白质上，然后用与生物素相连的报告标记分离出结合蛋白。最近，舒尔茨研究小组报告了一个使用这种方法的例子，叠氮化物作为光亲和探针结合到化合物上Kartogenin。Kartogenin可促进多能间充质干细胞（MSCs）选择性分化为软骨细胞，刺激受损软骨的修复。发现Kartogenin与丝蛋白A结合，破坏其与转录因子核心结合因子β亚基（CBFβ）的相互作用，并通过调节CBFβ-runx1转录程序诱导软骨形成[146]。最近，Theodoropoulos和他的同事们筛选了20万个小分子，以确定对12个人类肺癌细胞株的选择性毒性，Pulldown和化学蛋白质组学分析显示，该化合物直接与硬脂酰CoA去饱和酶（SCD）结合[147]。1.3基于小分子亲和性的非标记技术随着靶点鉴定小分子探针与目标蛋白质的结合，靶点靶点鉴定的范围扩大到包括对目标蛋白质具有低亲和力的小分子。然而，有很多小分子仍然不适用于基于小分子亲和探针标记的靶点鉴定方法。因此无标签标记的靶点鉴定方法已被建议作为这些小分子的解决方案。当小分子与其目标蛋白质结合时，蛋白质的热稳定性、蛋白水解性或化学稳定性发生变化，从而可以揭示小分子化合物作用蛋白靶点。1.3.1限制性酶切（Limitedproteolysis,LiP）LiP技术旨在测量非特异性蛋白酶（如枯草杆菌蛋白酶、热溶酶、蛋白酶K或pronase）简短处理后感兴趣蛋白的构象变化（Fig.1.6）[148]。蛋白质的构象可受多种因素的影响，包括翻译后修饰、疾病状态或配体结合，从而改变蛋白质的水解敏感性。LiP用于监测肿瘤特异性蛋白和磷酸化依赖蛋白的构象变化[149,150]。Piazza等人利用LiP在蛋白质组范围内监测蛋白质-代谢产物的相互作用，他们还使用了基于机器学习框架的LiP，对药物分子的真阳性靶蛋白进行优先排序，并在复杂真核蛋白质组中阐明药物结合位点[151]。Figure1.6.Generalschemesforlabel-freetargetidentification[87].1.3.2药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）2009年，利用LiP概念的提出DARTS作为非标签标记作用靶点鉴定的方法（Fig.1.6）[152]。在DARTS实验中，活细胞或细胞裂解物用化合物处理后，然后用蛋白酶处理（如pronase），然后用SDS分析，只有与化合物相结合的靶蛋白才能在凝胶上显示出差异，因为靶蛋白的水解敏感性随药物结合而发生变化。DARTS技术不仅用于验证药物靶点，而且用于未知靶点的小分子化合物靶点研究。Qu等利用2D凝胶电泳作为一种策略，提高了DARTS后蛋白的分离分辨率，鉴定阿昔替尼和硝唑尼特的靶蛋白[153,154]。尽管LiP和DARTS都可以鉴定潜在的靶蛋白以及生物活性小分子的结合位点，小分子与靶蛋白结合亲和力对蛋白质水解敏感性的影响是限制因素。1.3.3脉冲蛋白水解/氧化速率蛋白稳定性（SPROX）技术蛋白质可以通过化学品（即变性剂）变性，例如胍盐或尿素。变性蛋白质比完整蛋白质更容易受到蛋白水解或氧化的影响。在脉冲蛋白水解中，变性剂浓度依赖性蛋白质变性通过蛋白酶“脉冲”处理后的蛋白质裂解来评估[155]。在SPROX中，用甲硫氨酸氧化水平表示过氧化氢处理后蛋白质变性情况[156]。同时，蛋白质对上述蛋白质变性剂的稳定性可以在小分子结合时发生变化，因此蛋白水解稳定性和蛋白质氧化水平可以发生变化。脉冲蛋白水解技术被应用于小分子化合物的靶点鉴定，例如，用脉冲蛋白水解技术研究耻垢分枝杆菌中ATP结合蛋白。通过证实格尔德霉素与其靶蛋白HSP90之间众所周知的相互作用，证明了SPROX在整个裂解液中进行试验的可行性[157]。在另一研究中，SPROX发现他莫昔芬在MCF7乳腺癌细胞中的靶点为YBX1。此外，通过基于SPROX和脉冲蛋白水解的方法，发现天然抗癌药物ManassantinA的作用靶蛋白为EEF1A1。尽管有这些成功的例子，但基于脉冲蛋白水解和SPROX的目标识别方法仍有局限性，因为这两种方法都只适用于细胞裂解物，而不适用于活细胞系统。此外，SPROX仅适用于含有蛋氨酸残基的蛋白质。1.3.4CETSA、TPP和TS-FITGE随着温度升高，蛋白的折叠结构会发生变性，然后蛋白质发生聚集[158,159]。蛋白质具有抵抗热变性的固有特性，这可以通过熔解温度（Tm，一半蛋白质变性时的温度）来描述。蛋白质与其他分子（包括小分子）的相互作用可以改变它们的自由能和热稳定性。为了在体外筛选与靶蛋白结合的配体，在化合物存在或不存在的情况下监测蛋白质热稳定性的变化[160]。MartinezMolina等人在2013年建立了CETSA来监测药物在活细胞和细胞裂解物中的作用[161]。在CETSA中，细胞或裂解物用药物处理，然后在不同温度范围内加热，获得候选靶蛋白的热变性曲线，然后测量Tm位移（ΔTm）以确认药物与其已知靶标的结合。由于CETSA需要蛋白质印迹法进行检测，因此其使用受到靶点信息和抗体可用性的限制。另外，通过使用具有同量异位标记的多重定量质谱法开发了热蛋白质组图谱（TPP）技术（Fig.1.6）[162]。在TPP中，蛋白质被消化成肽，并与10-plex串联质标记（TMTs）结合。在10个不同温度下加热的蛋白质用温度范围内的TMT10plex（TPP-TR）标记，可以绘制10个温度点下的熔化曲线。根据曲线计算Tm，如果药物治疗导致Tm相对于对照显著偏移，则选择靶蛋白。另外，TPP也可以在不同化合物浓度范围（TPP-CCR）上进行，其中加热温度是恒定的，而使用10种不同的化合物浓度绘制剂量依赖性的稳定性变化[163]。另一种基于CETSA的无标记化学蛋白质组学方法是TS-FITGE，一种使用热稳定性偏移概念无标签的FITGE（Fig.1.6）[164]。在TS-FITGE中，在生物活性化合物存在或不存在的情况下热变性蛋白质后，热变性蛋白质组中的可溶性蛋白质部分分别与两种不同的荧光染料Cy3和Cy5结合。将Cy3-蛋白质组和Cy5-蛋白质组在相同温度下进行二维凝胶电泳。通过叠加Cy3和Cy5通道的图像，可以看到目标蛋白的热稳定性变化。TS-FITGE通过识别先前已知靶点的甲氨蝶呤和苔藓抑素1靶点以及天然产物hordenine的未知靶点进行验证。为了鉴定Hela特异性细胞毒化合物SB2001的靶蛋白，由于TS-FITGE和TPP在许多方面的差异，包括标记步骤（蛋白与肽）、分离方法（液相色谱与2D凝胶电泳）、检测方法（质谱与荧光成像）和读数（Tm位移与丰度差异）。尽管TS-FITGE只能在2D凝胶中看到一千个蛋白质点，TS-FITGE和TPP的结果给出了具有一定重叠的互补靶标，TS-FITGE显示了其在化合物鉴定相关靶蛋白的潜力[165]。1.4靶点鉴定技术-定量蛋白质组学在获得富集的靶蛋白后，需要对靶蛋白进行鉴定，其中利用质谱联合蛋白质组学分析是一种常用的研究策略[166,167]。在研究的早期，质谱用于鉴定电泳凝胶中的特定条带或两个斑点灰度差异来确定靶点，这种方法可能会导致低丰度靶点的损失和非特异性结果[168,169]。为了解决这些问题，已开发出用于测量多个样品中蛋白质丰度变化的定量蛋白质组学方法[170-172]。1.4.1细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）利用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC）技术联合LC-MS/MS平技术进行蛋白质丰度定量是最广泛使用的代谢标记方法[173]。该方法涉及两种细胞群的生长，一种在正常条件下（“轻”-天然氨基酸），另一种在稳定同位素标记的必需氨基酸（“重”-氨基酸，例如13C6-精氨酸，和13C6,15N2-赖氨酸)。“重”氨基酸被整合到所有新合成的蛋白质中，经过多次细胞分裂后，整个蛋白质组将被完全标记。由于同位素标记的氨基酸的特性与其天然对蛋白高度相似，“重”标记的细胞正常生长。然后分别对“轻”和“重”标记的细胞进行测试和对照实验。在质谱分析中，当比较“重”肽和“轻”肽的质谱时，这些同位素标记的肽对在它们的分离、分离和电离过程中表现相同，因为同位素氨基酸具有相同的物理化学特性，因此可以通过比较SILAC肽对之间的离子强度比来实现“重”肽与“轻”肽的相对定量，反映两个样品对之间的蛋白质丰度比[174,175]。1.4.2ICAT技术尽管SILAC功能强大，但不适用于标记无法维持足够长时间以确保蛋白质组完全标记的细胞（例如血小板），也不适用于标记收获的组织和人体体液。在这种情况下，化学标记是备选方案。有几种可用的策略，特别是使用同位素编码的亲和标签（ICAT）[176]或同量异位标签（iTRAQ）进行相对和绝对定量[177]。ICAT试剂包含亲和标签、同位素标记的接头和一个硫醇特异性反应基团（Fig.1.7）。要比较的蛋白质混合物的半胱氨酸残基的侧链用同位素轻或重形式的ICAT衍生试剂，将样品和胰蛋白酶消化后的标记肽通过亲和素亲和层析分离、分级并通过质谱进行定量分析。含有可切割接头的第二代ICAT试剂用于抗肿瘤化合物E7070的靶点鉴定，并成功发现其作用靶点为苹果酸脱氢酶（MDH）[178]。Fig.1.7Quantitativeproteomicsapproaches[89].1.4.3iTRAQ技术与SILAC相比，同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）是一种典型的化学标记方法，可用于对从蛋白质中消化的肽段进行稳定的同位素标记，并利用标记试剂对多肽片段进行定量[179,180]。例如，在天然微生物群落或原始组织样本中鉴定靶点，采用iTRAQ进行后标记是常用的方法[181]。此外，iTRAQ实验中可同时分析多达八种样品[182]。在iTRAQ中，将从不同组的蛋白质消化后与不同的iTRAQ试剂共孵育以进行同位素标记。由于不同iTRAQ试剂中报告离子的质量差异，因此可以用来计算不同组中的相对蛋白质丰度[183,184]。基于点击化学探针技术，将穿心莲内酯修饰成小分子探针，首先将探针或阴性对照与细胞共孵育，通过点击反应进行生物素修饰，靶蛋白富集后进行酶切，所得肽段分别用iTRAQ试剂标记，并通过LC-MS/MS进行鉴定和定量[183]。1.4.4.无标记半定量化学蛋白质组学方法除了使用蛋白质或肽的代谢和化学标记外，半定量无标记蛋白质组学方法也被用于化学蛋白质组学中，用于特异性鉴定药物靶点。对于非标记的定量蛋白质组学方法，通过检测特定蛋白质肽段的质谱信号密度来计算蛋白质丰度[185]。由于缺少标记过程，此方法在准确性和通量上都有缺点[186-188]。此外，每个样品只能进行一次质谱运行，因此必须在单独的质谱运行中检查不同组的样品，这可能会导致操作错误，从而导致结果准确性降低。1.5小结在天然药物的开发过程中，药物作用靶点的鉴定有助于确定药物作用机制和副作用，加速从发现到上市的过程。随着化学生物学和蛋白质组学的发展，化学蛋白质组学方法已成为活性小分子尤其是天然产物靶点鉴定的重要方法之一，为新型天然药物的研究和开发提供了重要的理论基础。在大多数情况下，天然产物分子需要用报告基团修饰以促进富集，这可能会影响其内在的药理活性，从而导致靶点结果有偏差。此外，非标记化学蛋白质组学方法在复杂情况下效果并不好，较低的准确性和通量限制了它们的广泛应用。因此，开发一种具有高通量的高精度非标记化学蛋白质组学方法势在必行。总的来说，化学蛋白质组学将继续成为推动天然活性产物开发的关键工具。参考文献[1]D.R.Green,F.Llambi,CellDeathSignaling,ColdSpringHarborperspectivesinbiology,7(2015).[2]L.Galluzzi,I.Vitale,S.A.Aaronson,J.M.Abrams,D.Adam,P.Agostinis,etal.,Molecularmechanismsofcelldeath:recommendationsoftheNomenclatureCommitteeonCellDeath2018,Celldeathanddifferentiation,25(2018),486-541.[3]D.Tang,R.Kang,T.V.Berghe,P.Vandenabeele,Themolecularmachineryofregulatedcelldeath,29(2019),347-364.[4]Z.Su,Z.Yang,L.Xie,J.P.DeWitt,Y.Chen,Cancertherapyinthenecroptosisera,Celldeathanddifferentiation,23(2016),748-756.[5]G.Majno,I.Joris,Apoptosis,oncosis,andnecrosis.Anoverviewofcelldeath,TheAmericanjournalofpathology,146(1995),3-15.[6]M.Leist,M.Jäättelä,Fourdeathsandafuneral:fromcaspasestoalternativemechanisms,Naturereviews.Molecularcellbiology,2(2001),589-598.[7]P.Nicotera,M.Leist,E.Ferrando-May,IntracellularATP,aswitchinthedecisionbetweenapoptosisandnecrosis,Toxicologyletters,102-103(1998),139-142.[8]S.J.Won,D.Y.Kim,B.J.Gwag,Cellularandmolecularpathwaysofischemicneuronaldeath,Journalofbiochemistryandmolecularbiology,35(2002),67-86.[9]P.Weerasinghe,L.M.Buja,Oncosis:animportantnon-apoptoticmodeofcelldeath,Experimentalandmolecularpathology,93(2012),302-308.[10]G.Yan,M.Elbadawi,T.Efferth,Multiplecelldeathmodalitiesandtheirkeyfeatures(Review),WorldAcadSciJ,2(2020),39-48.[11]M.D.Tibbetts,L.Zheng,M.J.Lenardo,Thedeatheffectordomainproteinfamily:regulatorsofcellularhomeostasis,Natureimmunology,4(2003),404-409.[12]S.Elmore,Apoptosis:areviewofprogrammedcelldeath,Toxicologicpathology,35(2007),495-516.[13]L.Galluzzi,E.H.Baehrecke,A.Ballabio,Moleculardefinitionsofautophagyandrelatedprocesses,36(2017),1811-1836.[14]L.Galluzzi,F.Pietrocola,J.M.Bravo-SanPedro,R.K.Amaravadi,E.H.Baehrecke,F.Cecconi,etal.,Autophagyinmalignanttransformationandcancerprogression,TheEMBOjournal,34(2015),856-880.[15]D.Gatica,M.Chiong,S.Lavandero,D.J.Klionsky,Molecularmechanismsofautophagyinthecardiovascularsystem,Circulationresearch,116(2015),456-467.[16]D.Denton,S.Nicolson,S.Kumar,Celldeathbyautophagy:factsandapparentartefacts,Celldeathanddifferentiation,19(2012),87-95.[17]Y.Liu,B.Levine,Autosisandautophagiccelldeath:thedarksideofautophagy,Celldeathanddifferentiation,22(2015),367-376.[18]P.Ravanan,I.F.Srikumar,P.Talwar,Autophagy:Thespotlightforcellularstressresponses,Lifesciences,188(2017),53-67.[19]M.Pajares,N.Jiménez-Moreno,J.García-YagüeÁ,M.Escoll,M.L.deCeballos,F.VanLeuven,etal.,TranscriptionfactorNFE2L2/NRF2isaregulatorofmacroautophagygenes,Autophagy,12(2016),1902-1916.[20]C.A.Mercer,A.Kaliappan,P.B.Dennis,Anovel,humanAtg13bindingprotein,Atg101,interactswithULK1andisessentialformacroautophagy,Autophagy,5(2009),649-662.[21]Y.Chen,D.J.Klionsky,Theregulationofautophagy-unansweredquestions,Journalofcellscience,124(2011),161-170.[22]N.Mizushima,Abriefhistoryofautophagyfromcellbiologytophysiologyanddisease,Naturecellbiology,20(2018),521-527.[23]I.Orhon,F.Reggiori,AssaystoMonitorAutophagyProgressioninCellCultures,Cells,6(2017).[24]H.Bhanot,A.M.Young,J.H.Overmeyer,W.A.Maltese,InductionofnonapoptoticcelldeathbyactivatedRasrequiresinverseregulationofRac1andArf6,Molecularcancerresearch:MCR,8(2010),1358-1374.[25]S.Sperandio,I.deBelle,D.E.Bredesen,Analternative,nonapoptoticformofprogrammedcelldeath,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,97(2000),14376-14381.[26]S.Sperandio,K.Poksay,I.deBelle,M.J.Lafuente,B.Liu,J.Nasir,etal.,Paraptosis:mediationbyMAPkinasesandinhibitionbyAIP-1/Alix,Celldeathanddifferentiation,11(2004),1066-1075.[27]D.Lee,I.Y.Kim,S.Saha,K.S.Choi,Paraptosisintheanti-cancerarsenalofnaturalproducts,Pharmacology&therapeutics,162(2016),120-133.[28]M.J.Yoon,A.R.Lee,S.A.Jeong,Y.S.Kim,J.Y.Kim,Y.J.Kwon,etal.,ReleaseofCa2+fromtheendop