ISO 299812024 乳制品.双歧杆菌的计数.37℃下的菌落计数技术°C标准立项发展报告

*乳制品双歧杆菌的计数37℃下的菌落计数技术标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Milkproducts—Enumerationofbifidobacteria—Colony-counttechnique摘要本报告聚焦于国际标准ISO29981:2024《乳制品双歧杆菌的计数37℃下的菌落计数技术》的立项与发展。随着全球益生菌市场的快速增长，双歧杆菌作为核心功能性菌种，其在乳制品中的准确定量成为保障产品质量、验证保健功效及满足法规监管的关键技术环节。本标准在原有的ISO29981:2010基础上进行了技术修订，旨在解决传统计数方法存在的菌种特异性不足、检测时间长及结果重复性差等问题。报告详细阐述了标准的修订背景、核心技术内容（包括原理、培养基配比、培养条件优化及菌落确认流程）、适用范围，并介绍了主要参与单位国际乳品联合会（IDF）的标准化工作。通过对该标准的深入分析，报告指出，实施ISO29981:2024将显著提升我国乳制品行业在双歧杆菌检测领域的国际接轨程度，为进出口贸易的技术壁垒破除、企业质量控制体系完善及消费者权益保护提供坚实的技术支撑。未来，该标准有望与分子生物学方法融合，推动双歧杆菌检测向更快速、更精准、更智能化的方向发展。关键词：双歧杆菌；菌落计数；乳制品；国际标准；益生菌检测；ISO29981Keywords:Bifidobacteria;Colony-counttechnique;Milkproducts;Internationalstandard;Probioticenumeration;ISO299811.引言ISO29981:2024《乳制品双歧杆菌的计数37℃下的菌落计数技术》正是在这一背景下应运而生的。该标准由国际标准化组织（ISO）食品技术委员会（TC34）联合国际乳品联合会（IDF）共同制定，于2024年11月26日发布，替代了原有的ISO29981:2010版本。作为益生菌检测领域的基石性技术标准，它确立了在37℃特定条件下，利用选择性培养基对乳制品中双歧杆菌进行菌落计数的基准方法。本报告旨在系统梳理该标准的立项背景、技术要点、修订内容及其对行业发展的深远影响。2.标准立项背景与修订动因2.1行业需求的迫切性乳制品中双歧杆菌的活菌计数，并非简单的微生物培养技术问题，而是直接关联到产品的功能性质量。双歧杆菌种类繁多，不同种属的菌株对氧气的耐受性、营养需求及代谢特性差异显著。乳制品中除了添加的目标双歧杆菌外，通常还含有发酵剂（如保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌）或其他益生菌（如鼠李糖乳杆菌）。因此，计数方法必须具备高度的选择性，以排除背景菌群的干扰，确保结果的准确性。旧版标准（ISO29981:2010）虽然奠定了良好基础，但在为期十余年的应用过程中，世界各国实验室反馈其操作流程、培养基性能、培养条件以及结果判读方面仍存在一些模糊地带和需要改进之处。2.2修订的主要动因根据ISO标准的周期性评审机制以及益生菌研究的最新进展，修订ISO29981的主要动因可归纳为以下几点：1.培养基配方的优化：原标准推荐的基础培养基（如TPY琼脂）及选择性添加物（如莫匹罗星锂盐、丙酸钠）在抑制乳酸菌等非目标菌时，有时会同时抑制部分对添加剂敏感的双歧杆菌菌株，导致计数结果偏低。新标准经过大量验证，调整了选择性添加剂的浓度或引入了新的抑菌剂组合，旨在平衡选择性与恢复率，提高检测的灵敏度和准确性。2.培养条件的明确化：对不同菌株在厌氧条件下的培养时间、气体环境的组成（如是否使用混合气体）等细节进行了更严格的技术规定，以消除因实验操作差异带来的结果偏差。特别强调了将培养温度精确控制在37℃±1℃的要求，这是双歧杆菌最适生长温度的核心条件。3.菌落确认方法的标准化：针对某些双歧杆菌菌落形态与乳杆菌等菌落难以区分的情况，新标准引入了初步的生化确认步骤或推荐了分子生物学确认方法（如16SrRNA测序）作为仲裁法，极大地提升了结果判定的权威性和准确性。4.与国际法规的衔接：随着欧盟、美国FDA以及中国《食品安全国家标准益生菌类保健食品》（GB16740）等法规的更新，对益生菌产品的质量控制提出了更高要求。标准的修订旨在与全球主要市场的监管要求保持一致，为贸易消除技术壁垒。3.标准核心技术内容分析ISO29981:2024标准的核心在于提供一种经典的、用于准确定量乳制品中活的双歧杆菌菌落形成单位（CFU）的平板计数技术。其主要技术内容如下：3.1原理该标准基于选择性培养原理。将稀释后的乳制品样品、均质后的样品悬液，接种于含有选择性添加剂的双歧杆菌计数琼脂培养基上。在37℃下进行严格厌氧培养（通常使用产气袋或厌氧培养箱，环境气体为N₂:CO₂:H₂约80:10:10）。经过特定时间（通常为48h至72h）的培养，双歧杆菌细胞形成肉眼可见的特征性菌落。通过计数符合典型形态学特征的菌落，并结合样品的稀释倍数和接种量，计算原样品中双歧杆菌的活菌数。3.2培养基与试剂标准详细规定了培养基的配方和配制方法，主要包括：-基础培养基：改良的TPY（胰蛋白胨、酵母膏、葡萄糖）琼脂，并添加了低聚糖等促进双歧杆菌特定酶活性的成分。-选择性添加剂系统：这是标准修订的核心。新标准推荐采用莫匹罗星锂盐（Li-mupirocin）与丙酸钠的组合。莫匹罗星能够有效抑制绝大部分乳酸菌（尤其是乳酸杆菌和链球菌），而丙酸钠则对双歧杆菌的抑制作用较弱。标准同时给出了必要时可使用的替代方案，但明确主方案为仲裁结果。3.3仪器与设备标准对关键设备提出了技术要求：-厌氧培养系统：厌氧罐、厌氧袋（需配备指示剂）或厌氧培养箱。必须确保整个培养过程中“严格厌氧”环境（氧气浓度低于0.5%）。-恒温培养箱：能够稳定维持在37℃±1℃。-菌落计数器及放大镜。-精密天平、pH计、灭菌器（高压蒸汽灭菌锅）等。3.4操作程序1.样品制备：依据产品特性（固体、液体、粉末），使用规定稀释液（如蛋白胨-生理盐水缓冲液）进行准确稀释。2.接种：通常采用倾注平板法（将1mL稀释液注入平板，然后倾注14-15mL已冷却至47℃的选择性培养基并混匀）或表面涂布法。对于均质后的样品，也支持使用螺旋接种仪。3.培养：平板固化后，倒置于厌氧环境中，于37℃±1℃下培养48h±3h。如果菌落不明显，可延长至72h。4.菌落计数与结果报告：-选择菌落数在30-300之间的平板进行计数。如果无菌落生长，报告为<1CFU/g或mL。-典型双歧杆菌菌落特征为：光滑、凸起、边缘整齐、直径通常为1-3mm，颜色从乳白到浅褐色不等。不同种属可能有微小差异。-确认步骤：对于可疑菌落，需通过革兰氏染色（阳性）、过氧化氢酶试验（阴性）进行初步确认。新标准增加了对特定菌落的F6PPK（果糖-6-磷酸磷酸酮酶）酶学检测或分子生物学检测作为确认手段，以排除假阳性。-最终结果以每克或每毫升样品所含的双歧杆菌菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）表示。3.5精密度与质量保证标准引用了多国实验室（多达20个）进行的协同性验证数据，给出了重复性（r）和再现性（R）的限值。要求实验室必须进行内部质量控制，包括使用标准菌株、培养基性能测试（阴性、阳性对照）以及参与能力验证计划。4.主要参与单位介绍：国际乳品联合会（IDF）ISO29981:2024标准的制定是ISO和IDF紧密合作的结果。其中，国际乳品联合会(InternationalDairyFederation,IDF)作为全球乳品行业最具权威性的非政府组织，在该标准的修订中发挥了主导草拟和技术支撑的核心作用。国际乳品联合会成立于1903年，总部设在比利时布鲁塞尔，至今已有超过120年的历史。其会员覆盖全球50多个主要乳制品生产国和消费国，通过各国国家委员会（如中国的中国乳制品工业协会、美国的美国乳品创新中心等）吸收专家参与工作。IDF的使命是“通过提供科学的、权威的全球乳品标准和指南，促进全球乳品行业可持续发展，推动乳品营养和健康的科学交流”。在标准ISO29981:2024的修订过程中，IDF的具体贡献体现在以下几点：1.技术专长的集中体现：IDF设有专门的分析方法标准委员会，旗下聚集了全球顶尖的微生物学家、化学家、乳品工艺专家。这些专家利用其在酸奶、发酵乳制品及婴幼儿配方奶粉领域的深厚造诣，为本标准的培养基优化、菌株敏感性测试及干扰因素排除提供了实验数据支持。2.国际协同验证的组织者：IDF在全球范围内组织了国际协同研究（CollaborativeStudy），协调不同地区的实验室使用相同方法对新配方培养基进行验证。这一庞大且严谨的验证工作确保了新标准在不同实验室间的可重复性和再现性，这是任何国际标准得以通过的关键。3.培训与推广的桥梁：IDF通过其年度会议、技术研讨会和在线培训课程，积极向全球会员推广新标准的操作细节。它帮助发展中会员国（如中国、印度、巴西）的实验室技术人员掌握新方法，提高全球乳品质量检测的整体水平。4.与ISO的协同机制：IDF与ISO在食品标准领域建立了独特的“双标号”机制（如ISO29981:2024|IDF250:2024）。这不仅避免了标准的重复制定，更重要的是确保了标准起草过程中集合了ISO的广泛国际代表性和IDF的深度技术专业性。5.结论与展望ISO29981:2024《乳制品双歧杆菌的计数37℃下的菌落计数技术》的发布，标志着全球乳制品行业在益生菌质量控制领域实现了一次关键性的技术跃迁。通过对培养基配方、培养条件和菌落确认方法的系统性优化，新标准极大地提高了双歧杆菌计数结果的准确性、选择性和重复性。这对于应对日益复杂的益生菌复配产品（例如同时含有双歧杆菌、乳酸杆菌、嗜热链球菌的酸奶），以及满足各国愈发严格的法规标准具有重要意义。对于中国乳制品行业而言，积极采用和转化ISO29981:2024标准（考虑将其转化为国家标准GB/T或行业标准）是融入全球贸易体系的必然选择。这意味着：1.提升国际竞争力：与国际同行使用相同标准进行检测，有助于消除因方法差异导致的技术性贸易壁垒，使国产优质益生菌产品更顺畅地“走出去”。2.强化质量内控：企业可以依据该标准优化自身的检测流程，更精准地监控从原料、生产过程到成品的活菌数，确保产品功效宣称的可靠性，建立品牌信誉。3.促进冷链与物流管理：双歧杆菌对温度和氧气极为敏感，准确的计数方法可以更科学地评估产品在运输和储藏过程中的活菌存活率，倒逼冷链物流和包装工艺的改进。展望未来，ISO29981标准的进一步发展将呈现以下几个趋势：-与快速分子生物学方法融合：虽然平板计数法是“活菌”检测的黄金标准，但其耗时较长（2-3天）。未来的修订版本或配套标准可能会纳入基于流式细胞术、实时荧光定量PCR以及新一代测序的快速非培养方法，作为新鲜样品或生产线上迅速放行的补充方法。-针对特定菌株的精细化：随着更多具有特定益生功能的双歧杆菌菌株（如长双歧杆菌BB536、乳双歧杆菌BB-12）的发现和应用，现有标准可能无法完全覆盖所有菌株的最佳培养条件。未来可能会出现针对特定菌株群或种属的“专属”计数标准。-数据化与智能化的结合