孤独症全基因组阳性位点在中国汉族人群的验证

/孤独症全基因组阳性位点在中国汉族人群的验证【摘要】目的：探讨孤独症全基因组关联研究(GWAS)显示关联的阳性单核苷酸多态性位点(SNPs)在中国汉族人群中是否与孤独症存在关联。方法：符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DSM-Ⅳ)诊断标准的孤独症儿童757例和成年正常对照1436例。选取既往GWAS中与孤独症全基因组水平显著关联的5个SNPs(NEGR1基因的rs1620977、CADPS基因的rs1452075、NUDT12基因附近的rs325506、COA8基因附近的rs10149470、KIZ基因附近的rs910805)和2个与既往报道阳性位点强连锁不平衡的SNPs(MMS22L基因附近的rs9375225和MROH5基因附近的rs746839)，应用AgenaMassARRAYSNP分型方法对SNPs进行基因分型。采用Pearson检验比较孤独症组和对照组各SNP等位基因和基因型的分布频率，分析其与孤独症的关联。结果：孤独症组NEGR1基因的rs1620977基因型和等位基因A的频率(病例vs.对照：17.2%vs.14.3%)和MROH5基因附近的rs746839的携带等位基因G的基因型频率(病例vs.对照：31.4%vs.26.0%)及G等位基因的频率(病例vs.对照：17，2%vs.14.3%)均高于正常对照组(P＜0.05)，且在男性中两组差异经Bonferroni校正后仍有统计学意义(P＜0.007)。结论：中国汉族人群中NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839与孤独症关联，可能是孤独症的易感位点。【关键词】孤独症；单核苷酸多态性；病例对照关联研究；NEGR1基因 孤独症是孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder，ASD)中最严重、最典型的一种神经发育障碍，临床主要表现为社会交往损害、语言和非语言交流障碍、重复刻板行为和兴趣范围狭窄。全球ASD的患病率约为1%，其中男女比例约为4∶1[1]。家系及双生子等研究提示遗传因素在ASD的病因中发挥重要作用[2]，该病遗传度高达80%～93%[2-3]。常见变异是ASD遗传风险的重要部分，其中单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)遗传风险约为50%[3]。既往欧洲人群ASD全基因组关联研究(genome-wideassociationstudy，GWAS)发现位于CDH10、MSNP1AS、GPC6等基因的SNPs与ASD显著关联，且MSNP1AS基因附近的rs4307059等位点在中国汉族人群中也是孤独症的易感位点，提示部分遗传位点可能在不同种族中均参与孤独症的发病[4-6]。最新ASD大样本GWAS发现多个全基因组水平显著关联的阳性位点，且均为该研究首次报道与孤独症关联，但这些位点与中国汉族人群孤独症是否关联尚不清楚。 因此本研究选取GWAS中与ASD关联的5个阳性位点以及2个与阳性位点强连锁不平衡的SNPs进行研究，探讨上述位点在中国人群中是否与孤独症存在关联。 1对象与方法 1.1对象及样本量 孤独症组：来源于2014年1月—2019年10月北京大学第六医院门诊患者。入组标准：①符合美国精神障碍诊断与统计手册第4版(DiagnosticandStatisticalManualofMentalDisorders，FourthEdition，DSM-IV)孤独症的诊断标准[7]，由2名以上儿童精神科副主任医师进行诊断；②患者及其生物学父母皆为汉族，患者年龄≤18岁，无家族性神经精神等遗传病史；③孤独症行为量表(AutismBehaviorChecklist，ABC)≥53分[8]；④儿童孤独症评定量表(ChildhoodAutismRatingScale，CARS)≥36分[8]。排除标准：①患阿斯伯格综合征(Aspergersyndrome)或未特定广泛性发育障碍(pervasivedevelopmentaldisorder-nototherwisespecified，PDD-NOS)；②患苯丙酮尿症、脆性X染色体综合征、结节性硬化或其他神经系统疾病；③患严重躯体疾病；④携带异常染色体核型。 正常对照组：同期于北京大学第六医院招募成年正常对照。入组标准：①年龄18～35岁；②正常对照及其生物学父母皆为汉族。排除标准：①患有神经、精神和严重躯体疾病；②有家族性遗传病史。 采用Quanto1.2.4软件估算样本量。孤独症患者与正常对照比例为1：2；孤独症全球患病率约为1%，设定人群风险为0.01[1]；依据所选取SNPs在中国汉族基因组数据库()的最小等位基因频率(minorallelefrequency，MAF)，设定等位基因频率为0.13～0.43；根据既往文献设定遗传效应值为1.3～1.5[9-10]；Ⅰ类错误概率P＜0.05(双侧)；当power为0.8时，估算样本量为孤独症组680例，对照组1300例以上。 本研究共纳入757例中国汉族孤独症患者(男性665例，女性92例)，1436例中国汉族正常对照(男性1273例，女性163例)，2组性别差异无统计学意义(=0.31，P＞0.05)。患者年龄中位数4.8(3.0，16.7)岁。 本研究获北京大学第六医院伦理委员会批准；所有对象均详细了解本研究的目的和内容，并签署知情同意书；孤独症患者由其法定监护人签署知情同意书。 1.2工具 1.2.1孤独症行为评定量表-ABC[8]180-184 用于评定孤独症症状，由描述孤独症儿童的感觉、情绪、行为和语言等方面异常表现的57个条目组成。各条目评分按在量表中的负荷大小分别评为1、2、3、4分。得分越高表示孤独症行为程度更严重。孤独症筛查界限分为53分[8]。 1.2.2儿童孤独症评定量表-CARS[8]180-184 用于评估孤独症儿童行为表现异常程度，包含15个条目，每个条目共设定4级：与年龄相当的行为表现、轻度异常、中度异常和严重异常，对应评分分别为1、2、3、4分。总分≥36分时评为重度孤独症，总分30～35分时评为轻～中度孤独症，总分＜30分则评为非孤独症[8]。 1.3样本处理和SNPs基因型检测 1.3.1样本DNA提取 所有研究对象抽取外周静脉血5mL。采用Qiagen公司血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，质检合格后保存于-20℃冰箱。 1.3.2SNPs位点的选择、引物设计及基因分型 在PubMed(/pubmed)和GWAScatalog(http://www.ebi.ac.uk/gwas)搜索孤独症/孤独症谱系障碍相关GWAS文献，挑选在中国汉族人群中尚未进行研究的12个GWAS关联位点。参考中国汉族基因组数据库，挑选在中国汉族人群中MAF＞0.05的SNPs位点。参考精神病基因组学联盟数据库(/pgc/data)，挑选与ASD关联的位点(P＜0.05)。最终选取7个ASD全基因组水平显著关联的SNPs(NEGR1基因的rs1620977、CADPS基因的rs1452075、NUDT12基因附近的rs325506、MMS22L基因附近的rs2388334、MROH5基因附近的rs11787216、COA8基因附近的rs10149470和KIZ基因附近的rs910805)进行研究[11]。 用AgenaBioscience在线软件(/Home)进行多重PCR引物设计。其中2个SNPs(rs2388334和rs11787216)引物与其他SNPs引物不兼容，故采用Haploview4.2软件分析后选取物理位置较近的强连锁不平衡位点rs9375225和rs746839进行基因分型。采用AgenaBioscience基因分型试剂盒进行扩增产物制备后经AgenaBioscience质谱仪检测及SNPs基因分型。 1.4统计方法 采用Quanto软件计算统计功效，SPSS24.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布采用(均数±标准差)进行统计描述，不符合正态分布则采用中位数(最小值，最大值)进行统计描述。采用拟合优度检验判定SNPs基因型是否符合Hardy-Weinberg平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)。采用Pearson检验计算两组间基因型和等位基因的分布是否存在差异，P值均为双侧性。采用Bonferroni方法对P值进行多重检验校正，显著性P值设定为0.007(P＜α/n=0.05/7=0.007)。 2结果 2.1质量控制 7个SNPs的基因分型结果聚类清晰，所有位点的分型成功率均＞97.8%。所有位点的统计功效在0.83～0.98之间。正常对照中所有SNPs基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)(表1)。 2.2孤独症组和对照组7个SNPs基因型分布频率比较 NEGR1基因的rs1620977携带等位基因A的基因型(AA+AG)孤独症组频率高于正常对照组(30.4%vs26.3%，P＜0.05)，经Bonferroni校正后结果无统计学意义(表2)。孤独症组MROH5基因附近的rs746839携带等位基因G的基因型(GC+GG)频率高于正常对照组(31.4%vs26.0%，P＜0.05)，且在男性样本中差异经Bonferroni校正后仍有统计学意义(P＜0.007)(表2)。 2.3孤独症组和对照组7个SNPs等位基因分布频率比较 孤独症组NEGR1基因的rs1620977等位基因A频率高于正常对照组(17.2%vs14.3%，P＜0.05)，且在男性样本中差异经Bonferroni校正后仍有统计学意义(P＜0.007)(表3)。MROH5基因附近的rs746839等位基因G在孤独症组频率高于正常对照组(17.2%vs14.3%，P＜0.05)，且在男性样本中差异经Bonferroni校正后仍有统计学意义(P＜0.007)(表3)。 3讨论 本研究探索孤独症全基因组水平显著关联SNPs与中国汉族孤独症的关联，结果发现位于NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839与中国汉族孤独症关联。本研究发现孤独症组rs1620977携带A等位基因的基因型(AG+AA)和A等位基因及rs746839携带等位基因G的基因型(GC+GG)和G等位基因的频率高于对照组，且在男性样本中后三者的差异经Bonferroni多重检验校正后仍有统计学意义。 本研究发现在男性孤独症群体中rs1620977和rs746839携带风险等位基因的基因型和风险等位基因频率更高。既往研究在男性ASD患者家系中发现新的与孤独症连锁的染色体区域[12]。此外，部分基因的新生突变在神经发育障碍的男性中富集[13]。本研究及既往研究均提示，孤独症男性可能对某些致病因素更为易感或富集某些致病因素。 注：SNP，单核苷酸多态性。 本研究发现在中国汉族人群中rs1620977与孤独症关联，这与既往研究在欧洲人群中ASD和重度抑郁障碍GWAS的meta分析发现rs1620977达到全基因组水平显著关联一致[11]。此外，另有研究发现rs1620977与正常人的受教育程度和认知能力关联[14-15]。本研究发现的孤独症关联位点rs746839，在精神病基因组学联盟对8种精神疾病的meta研究中与ASD和精神分裂症关联[16]。此外，Grove等人的GWASmeta分析发现rs11787216在全基因组水平与ASD及欧洲人群受教育程度显著关联[12]，该SNP位点与本研究的rs746839物理位置接近且存在强连锁不平衡(B4AG263.jpg=0.92)。上述研究结果均提示在欧洲人群及汉族人群中NEGR1基因的rs1620977和MROH5基因附近的rs746839与孤独症等神经发育疾病或相关特征关联。 本研究发现NEGR1基因的rs1620977与孤独症关联。NEGR1基因位于染色体1p31.1区域，可编码神经生长调节蛋白1。Braineac数据库()显示rs1620977是NEGR1基因的顺式作用表达数量性状基因座，可能影响该基因的表达水平。GWASCatalog数据库表明NEGR1基因的部分SNPs与神经精神疾病及孤独症相关特征显著关联。有研究发现位于NEGR1基因的rs7531118与孤独症和精神分裂症关联[16]。此外，有研究报道1例男孩染色体1p31.1-p31.3区域存在约6.5Mb的缺失，导致NEGR1等20个基因缺失；该男孩具有注意缺陷、智力障碍及语言障碍等孤独症相关临床表现[17]。另有研究发现一对同胞姐弟存在1p31.1染色体区域约315kb的拷贝数缺失，导致NEGR1基因部分缺失；此姐弟皆患有注意缺陷多动障碍伴发育障碍，且弟弟具有社交技能和交流能力缺陷等孤独症相关临床表现[18]。 功能研究发现NEGR1基因可调节神经突生长和树突棘密度[19-20]。下调小鼠脑内NEGR1基因发现神经元迁移异常，而ASD患者和相应动物模型均存在神经元皮层发育异常[20]。下调NEGR1基因表达或敲除NEGR1基因的小鼠出现社交能力和学习能力受损等ASD相关的行为表现[20-21]。上述研究提示NEGR1基因可能是ASD的易感基因，参与孤独症发病。 本研究发现孤独症GWAS阳性位点NEGR1基因的rs162097