CN116328042B 一种组织工程水凝胶支架及其制备方法和应用 （上海大学）

一种组织工程水凝胶支架及其制备方法和述组织工程水凝胶支架包括含有骨髓间充质干细胞和内皮细胞的胶原蛋白微球和由甲基丙烯述甲基丙烯酰化明胶交联网络中甲基丙烯酰化适用于3D打印技术领域以制备复杂结构的组织功能支架，且能保证负载的种子细胞(BMSCs和2S1、将含有骨髓间充质干细胞和内皮细胞的细胞悬S5、将凝胶态生物墨水注入装有点胶针头的生物3D通过微流控技术，采用油包水结构制备胶原蛋白液滴时，以所述微球前所述甲基丙烯酰化明胶交联网络为甲基丙烯酰化明胶光交联网络，由4.如权利要求1_3任一项所述的组织工程水凝胶支架在制备组织工程支3和功能性。临床上自体骨移植和同种异体骨移植等手术方法是治疗严重骨缺损的主要方力并在体内可生物降解的支架与具有诱骨活性的自体治疗性细胞(如骨髓间充质干细胞)支架更能模拟人体的骨组织结构，为水凝胶应用于骨组织工程移植物提供了强有力的支45[0026]本发明第三方面提供了的如上所述的组织工程水凝胶支架或如上所述的组织工[0032]图3为本发明实施例的组织工程水凝胶支架以及由其制备的组织工程支架的制备[0035]为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、6干细胞和内皮细胞的胶原蛋白微球和由甲基丙烯酰化明胶交联网络和纤维蛋白形成的水进而形成含有骨髓间充质干细胞和内皮细胞的载多细胞胶原蛋白微球结构(图1中简称为载多细胞微球)，之后通过将胶原蛋白微球与甲基丙烯酰化明胶(GelMA)和纤维蛋白(FIB)水凝胶支架经3D打印成型后中细胞的存活率达到87养的BMSCs和HUVECs细胞产生自发组装的血管网络，高效诱导血管生成并促进成骨细胞分微球数量会影响其力学性能，进而影响由纤维丝制成程支架在植入体内后受到的力是一个面承受的压力，即抗压强度)和结构稳定性，一般而105_8×105个/mL，即所述细胞悬液中骨髓[0047]所述胶原蛋白微球中两种细胞的生长状态会一定程度上影响水凝胶支架材料中施方式中，所述细胞悬液中所述内皮细胞(HUVECs)和所述骨髓间充质干细胞(BMSCs)的浓优选所述内皮细胞和所述骨合温度下受光激发分解成自由基，自由基引发甲基丙烯酰基明胶(GelMA)分子链之间相互8[0057]所述组织工程水凝胶支架的制备方法与如上所述的组织工程水凝胶支架相对于挥去溶剂固化得到微球的方法。具体而言，成的胶原蛋白液滴在微通道中用37℃水浴固化，最后在装置的出口处收集成型的直径为微球前体溶液的泵入流速为5_30μL/min，所述连续相无菌矿物油的泵入流速为50_300μL/9[0067]本发明又一实施例提供了如上所述的组织工程水凝胶支架或如上所述的组织工程水凝胶支架的制备方法制备得到的组织工程水凝胶支架在制备组织工程支架尤其是骨[0068]所述组织工程水凝胶支架在制备组织工程支架的应用优势与如上所述的组织工得到含平均直径为350μm的胶原蛋白微球悬液，将悬液轻轻摇动，并沉淀5min以与油相分[0076]BMSCs细胞悬液制备：用0.25％胰蛋白酶收获培养的BMSCs，以1000r/min离心[0077]HUVECs细胞悬液制备：用0.25％胰蛋白酶收获001_1ACS)和1％双抗，所述双抗包括青霉素和控温光固化喷头装置运动速度为5mm/s，打印平台控温为10℃,365nm紫外辐射灯光固化功载HUVECs的胶原蛋白微球，再将两种载细胞的胶原蛋白微球溶液与聚合物前体溶液混合，[0091]BMSCs细胞悬液制备：用0.25％胰蛋白酶收获培养的BMSCs，以1000r/min离心[0092]HUVECs细胞悬液制备：用0.25％胰蛋白酶收获[0093]将1.5mL浓度为9mg/mL的I型胶原蛋白溶液加入含BMSCs的悬液A中，并在4℃条件[0095]分别以I型胶原蛋白溶液C1和C2作为分散相，按照实施例2的方法制备载BMSCs的[0100]血管化情况分析实验：使用免疫组化法测定血小板内皮细胞粘附[0101]成骨分化情况分析实验：使用实时定量聚合酶链反应(RT_qPCR)测量成骨特异性水平以评估骨支架的成骨分化情况。根据制造商的方案用细胞/组织总RNA提取试剂盒(MolpuregCell/TissueTotalRNAKit)提取总RNA，并使用微量紫外分光光度计在260nm处测定其含量。使用EasyQuickRTMasterMix制备cDNA第一链。而后，在PCR仪上使用[0102]微球形态及分散效果、纤维丝横截面的微球个数观察：通过倒置显微镜(NIKON[0103]支架力学性能分析实验：将纤维丝放置在带有圆形金属板的称重传感器(25kgf)[0107]通过比较血小板内皮细胞粘附分子(PECAM_1，内皮标志物)mRNA表达水平评估骨支架中的血管化情况，通过含载成骨细胞特异性I型胶原(COL_1，早期成骨分化标志物)分化标志物)mRNA表达水平评估骨成骨分化情况。血管化及成骨分化标志物的表达测试实[0108]本发明实施例1_4所制备得到的组织工程水凝胶材料具有良好的力学性能，其抗[0110]通过实施例2_4可以发现，甲基丙烯酰化明胶和纤维蛋白的比例会影响水凝胶支化明胶交联网络比例的降低，所成型的支架整体7：1的比例时，由于支架中纤维蛋白多