（正式版）DB34∕T 2167-2014 《油菜黑胫病菌鉴定方法》

DB34DB34/T2167—2014油菜黑胫病菌鉴定方法DetectionandidentificationofLeptosphaeriabiglobosa(Desm.)Ces.etDeNot.安徽省质量技术监督局发布I1本标准规定了油菜黑胫病菌的现场和室内鉴定的依据GB/T6682分析实验室用水规格和试验油菜黑胫病菌Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.&deNot.属真菌界(Fungi)，鉴定依据：以油菜黑胫病为害症状、病菌形态），琼脂培养基（Agar），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA-potatodextroseAgar），马铃薯葡萄糖2油菜黑胫病菌（Leptosphaeriabiglobosa(Desm)Ces.——子叶/叶片症状：黑色坏死斑点（由致病力弱的菌株造成）；或灰白色病斑（由致病力强的菌），在衰老菌丝体上可观察到黑色小粒点（为分生孢子器），（见附录D，图1、2、3、4）；分生孢子器球2个油球，分生孢子大小3～5.5μm×1.3～2.7μm（见附录D，图5）。子囊壳呈球形，黑色，有孔口，直径360μm～500μm；子囊棍棒形，内有8个子囊孢子，（见附录D，图6）；子囊孢子长椭圆形，具5～8个隔膜，黄褐色，大小（30～，（基上培养获得分生孢子，用无菌水配置成浓度为107/mL分生孢子悬浮液。选取健康感病油菜品种播分生孢子悬浮液。将接种过的幼苗保湿48小时（约100％相对湿度），期间如有新生真叶出现，3将其剪去，以延缓子叶衰老的时间。在接种后7～14d观察子叶发病情况。子叶侵染症状的主要特），分离鉴定的菌株应妥善保存，菌株在PDA平板培养后可于4℃冰箱保存，每90d定期继代，或将带有菌丝的培养基块转入30%灭菌甘油中于4A.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseA.3马铃薯葡萄糖肉（potatodextrosebroth，PDB）液体培5(资料性附录)油菜黑胫病菌为害植株典型症状图B.5茎秆干枯时病斑呈灰白色，灰白色病斑中可见小黑点(分生孢子器)图B.6病斑部位横切面可见组织患病呈黑色图B.7染病植株茎基部腐烂6将采集疑似症状的植株样本用自来水洗净，晾干组织表面的水；从油菜植株的病斑处切取大小约表面消毒约2min，无菌水清洗2～3次，用无菌滤纸吸干表面多将表面消毒后的油菜种子（或油菜籽）或植物组织样品置琼脂培养基上，100mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素）上，20℃培养5～7d，挑取菌丝体边缘少量菌丝转移至不含抗生素的PDA培养基上，培养3～6d，再次挑取边缘菌丝接种至PDA培养基，直7图D.5分生孢子图D.6假囊壳图D.7子囊孢子8）；％（-HCl、1.4MNaCl、20mMEDTA、1%β-巯基乙醇。1)将小片（约2mm×2mm）植物病斑组织置1.5ml离心管中，预先冷冻（-20℃)数小时后，进行低温冷冻干燥处理(﹥24h2)使用与离心管匹配的金属（或塑料棒）将干燥后的样品充分碾碎；培养基中，水平振荡培养（23℃,180rpm）10d，14000×g离心5min收集菌丝，提取菌丝体DNA。(1)将菌丝进行低温冷冻干燥处理(﹥24h），保存在-20℃待用；9(规范性附录) 1.2μL,10×Buffer:2.0μL,dH20:8.2取5μL扩增产物与1μL的样品缓冲液(loadingbuffer)混匀，在1%琼脂糖凝胶(含0.1%EB)中电泳(电泳缓冲液1×TAE,电压120V,时间1h),在凝胶成像