烟草鉴别检测 DNA分析法2026

1范围2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本规程必不可少的条对应的版本适用于本规程；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规程。下列术语和定义适用于本规程。一类由脱氧核苷酸通过3',5'-磷酸二酯键连接组成的带有遗传信息的线性或环状生物大分子。4原理针对烟草和烤烟品种DNA序列设计特异引物对，提取检测样品的DNA,使用烟草和烤烟品种特异引物对检测样品的DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩有烟草和烤烟品种。最低检出限(LOD)为0.1%(质量分数)。将样品制备成相同规格的粉末后提取DNA,随后开展文库构建与高通量测序(测序深度不低于30×),对样品测序数据进行特异位点提取并与标准库内烤烟品种特异位点比对，计算特异位点匹配度，判定检测样品中是否含有5.1水，应符合GB/T6682中三级水的规定，且水中应无DNA酶(降解DNA)活性，也不应存在足以使引物产生扩5.7琼脂糖凝胶：称取1.00g琼脂糖于250mL三角瓶中，加入100mL1×TAE缓冲液(5.5),加热沸腾至溶液呈透5.8引物对：包含SSR-1/SSR-2、SSR-3/SSR-4。SSR-1、SSR-2用于烟草的检测，SSR-3、SSR-4用于烤烟品种检测SSR-1引物序列信息5′-AAAGCGACATTACGAAACTAGAAA下游引物5′-GGGTTACACTGTCAAGGSSR-2引物序列信息5′-TGCACATAGGAAACACTTTAG下游引物5′-TTGAGATTTGGGTTCTTA用于烤烟品种检测SSR-3引物序列信息5′-TTGCCACTTGAACTAA下游引物5′-GGGAGCAAAGTACCATATSSR-4引物序列信息5′-TCAAGATCTGATCACCAA下游引物5′-ACATTGAATTGGGCGTGAAT5.9凝胶迁移标记物(DNAmarker):已知大小的DNA混合物，用于与检测样品同时进行电泳以提供片段大小的5.102×Taq预混液(染料)。5.13异戊醇，分析纯及以上。5.16乙醇，分析纯及以上。5.18双蒸水。6.6凝胶成像系统。6.7研磨仪。6.8高通量测序仪。7.1.3检测前，应先去除辅料后混匀。若进行烟草检测、烤烟品种检测，每个检测样品应平行检测两次；若进行烤7.2.1DNA提取DNA提取按照附录A的规定进行。若进行烟草检测，应选择SSR-1或SSR-2引物对(5.8)进行DNA扩增；若烟草检测后需进行烤烟品种检测，应将7.2.1制备好的DNA进行稀释，DNA扩增所用样品DNA质量不低于100ng。实验所采用的PCR反应体系如表2所示。5′-引物(10μmol/L)3′-引物(10μmol/L)水(5.1)2×Taq预混液(染料)PCR反应程序为：94℃预变性5min;94°℃变性50s,48℃复性30s,72℃延伸30s,共35个循环；72℃延伸10min;10℃保持10min。DNA扩增应同时进行阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照为：将稀释后的烟草/烤烟品种的DNA进行扩增。阴性对照为：将稀释后的不含烟草/烤烟品种的DNA进行扩增。空白对照为：不加入DNA,补充无菌水，进行扩增。7.2.3凝胶电泳7.3烤烟品种分型检测烤烟品种分型检测按照附录C的规定进行，流程图见图C.1。A.1有包衣的颗粒状检测样品，应按如下方法进行包衣洗脱：将适量颗粒状检测样品放入50mL锥形瓶中，加过量水至检测样品完全浸润，静置至包衣完全裂开且溶于水中；将50mL锥形瓶中液体倒入放置四层纱布的漏斗中过A.2内源性检测，应按如下方法进行外源物洗脱：取0.20g检测样品于50mL离心管中，加入20mL灭菌水，振荡1min,用针筒水相滤膜过滤，收集残渣。将残渣再次用灭菌水洗脱(每次2mL、振荡1min),一共洗脱5次，收集A.3无需进行包衣洗脱或内源性鉴别，可直接取0.20g检测样品按A.4进行DNA提取。A.4DNA提取：将经上述处理后的检测样品置于2mL离心管中，按照柱式植物DNA提取试剂盒或等效试剂盒 (5.2)说明书方法进行DNA提取，最后用超微量紫外分光光度计测定DNA浓度和质量。经适当稀释后直接用于M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.白肋烟样品；7、8.香料烟样品；9、10.晒烟样品；11、12.雪茄烟样品；13、14.烟碱样品；15、16.空白对照样品。M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.白肋烟样品；7、8.香料烟样品；9、10.晒烟样品；11、12.雪茄烟样M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.白肋烟样品；7、8.香料烟样品；9、10.晒烟样品；11、12.雪茄烟样品；13、14.烟碱样品；15、16.空白对照样品。M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.白肋烟样品；7、8.香料烟样品；9、10.晒烟样品；11、12.雪茄烟样M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烟草样品；5、6.非烟样品；7、8:非烟样品和烟草样品质量比9:1的混合样品；9、10:非烟样品和烟草样品质量比99:1的混合样品；11、12:非烟样品和烟草样品质量比999:1的混合样品。M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烟草样品；5、6.非烟样品；7、8:非烟样品和烟草样品质量比9:1的混合样品；9、10:非烟样品和烟草样品质量比99:1的混合样品；11、12:非烟样品和烟草样品质量比999:1的混合样品。M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.非烤烟品种样品；7、8:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比9:1的混合样品；9、10:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比99:1的混合样品；11、12:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比999:1的混合样品。M:DNAmarker;1、2.阳性对照样品；3、4.烤烟样品；5、6.非烤烟品种样品；7、8:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比9:1的混合样品；9、10:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比99:1的混合样品；11、12:非烤烟品种样品和烤烟样品质量比999:1的混合样品。称取约2g样品至2mL离心管中，放入研磨条件为65Hz、时间120s的研磨仪(6.7)中研磨(也可用其他仪器将样品充分研磨),然后过40目筛网。将过筛粉末立即装入洁净干燥的密封袋中密闭起来，充分摇动，混匀后备称取C.1得到的待测烟末0.10g于5mL离心管中，加入1500μL、70℃预热30min的CTAB提取液(5.11),在70℃水浴裂解30min,每10min上下颠倒摇匀。然后加入1500μL、-20℃液(5.14)和500μL异丙醇(5.15),放入-20℃冰箱静置1h。静置后样品以12000r/min转速离心10min,弃去上清液后，加入1000μL1.2mol/L氯化钠(5.17)溶液静置3min,待沉淀溶解后，加入1200μL异丙醇(5.15) (-20℃预冷),混匀后于-20℃条件下静置30min。然后以12000r/min转速离心10min,弃去液体，随后用1000μL70%乙醇(5.16)溶液洗涤2次，第二次洗涤后开盖3-5min使乙醇完全挥发。最后加入200μ