2027创新设计一轮生物 高考共鸣点12　PCR引物的设计、修饰、选择与计算及限制酶、启动子的选择

PCR引物的设计、修饰、选择与计算及限制酶、启动子的选择高考共鸣点12热点考情速览PCR引物的设计、修饰、选择及相关计算2025·河北卷，22；2025·陕晋宁青卷，21；2025·湖南卷，21；2025·新课标卷，34；2025·河南卷，20；2025·四川卷，19；2025·安徽卷，20；2024·广西卷，21；2024·山东卷，25；2024·辽宁卷，25；2024·江西卷，23；2024·天津卷，16；2024·湖南卷，15；2024·浙江6月选考，19；2024·新课标卷，15；2024·河北卷，22；2023·重庆卷，12；2023·辽宁卷，25；2023·江苏卷，22；2023·山东卷，25PCR技术中限制酶和启动子的选择2025·陕晋宁青卷，21；2025·山东卷，25；2025·甘肃卷，21；2025·河南卷，21；2024·广西卷，21；2024·广东卷，21；2024·全国甲卷，38；2024·重庆卷，19；2024·江西卷，12；2024·河北卷，22；2024·福建卷，17；2024·湖南卷，21；2024·浙江1月选考，22；2024·江苏卷，23；2024·山东卷，251目

录PCR引物的设计、修饰、选择及相关计算2PCR技术中限制酶和启动子的选择热点1

PCR引物的设计、修饰、选择及相关计算1.PCR引物的设计和修饰 (1)PCR引物的设计原则 ①引物长度要适宜。一般引物过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。

②引物内部应避免自身互补。③引物之间应避免互补。尤其应避免3′端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。(2)引物的特异性和修饰提醒为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，这是为了保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。[例1]

设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图)，请分别说明理由。①第1组：_________________________________________________________；②第2组：_________________________________________________________。引物Ⅰ与引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效[例2]

(2022·山东卷，25节选)为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的

(填“3′端”或“5′端”)。5′端2.PCR引物的选择 (1)引物的结合方向[例3]

如图为X蛋白的部分基因序列，所示序列为引物结合的部分，据图分析：扩增X蛋白基因所需的引物序列是

；__________________________________________________________________。5′－ATGCCGTAAGTCCTAC－3′5′－TGATCTACGGCTTACA′－3解析书写引物序列，一般从引物的5′端向3′端书写，避免误判。图中位于上方的模板链5′端磷酸基团在左侧，3′端羟基在右侧，可知与上方模板链配对的引物5′端在右侧，3′端在左侧，引物序列为5′－TGATCTACGGCTTACA－3′。同理推测另外一条引物的序列。[例4]

土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为(

)AA.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′解析图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面链的引物)作为引物对，A符合题意。A.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B.5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D.5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′(2)目的基因是正向连接还是反向连接的检测①利用电泳进行检测——检测长度②利用PCR进行检测——能否正常进行扩增[例5]

研究人员构建了含GDNF基因的表达载体(如图1所示)，

请回答：经酶切后的载体和GDNF基因进行连接，连接产物经筛选得到的载体主要有三种：单个载体自连、GDNF基因与载体正向连接、

GDNF基因与载体反向连接(如图1所示)。

为鉴定这3种连接方式，选择Hpa

Ⅰ酶和BamHⅠ酶对筛选的载体进行双酶切，并对酶切后的DNA片段进行电泳分析，结果如图2所示。图中第

泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。

②解析由图可知，载体上有Hpa

Ⅰ酶切位点，无BamHⅠ酶切位点，则载体自连情况下电泳得到的条带只有一条且分子量为6000bp，即①；基因与载体正向连接或反向连接的情况下，都有BamHⅠ和Hpa

Ⅰ两个酶切位点，经酶切可产生两个片段，且正向连接时，Hpa

Ⅰ和BamHⅠ酶切位点之间有700bp，反向连接时Hpa

Ⅰ和BamHⅠ酶切位点之间有200bp，则载体正向连接后产生一个700bp和一个6000bp的条带，即②。[例6]

(2019·江苏卷，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是

。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_________________________________。乙、丙目的基因反向连接解析分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。[例7]

(2023·山东卷，25节选)科研人员构建了可表达J－V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图所示：构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图中的引物

。F2和R1或F1与R2解析据图可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。(3)引物与复性温度①复性温度：复性温度高，扩增特异性强，但扩增效率低；复性温度低，扩增效率高，但扩增特异性低。②引物：引物长度越长，越容易形成氢键，为避免出现错配，需要适当提高复性温度；引物GC含量越高，越容易出现非特异性结合，需要适当提高复性温度。[例8]

科学设计引物是PCR能否成功的关键，若引物的碱基过多或引物的G、C含量过高，会造成PCR的效率偏低，收获的目的基因较少，原因是__________________________________________________________________。

若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现有两个或多个条带，从引物角度分析，原因可能是__________________________________________。引物与模板链结合过于紧密，变性时引物不易与模板链脱离(影响变性)引物过短导致引物的特异性下降3.引物的数量计算 (1)如图：一个DNA分子n次扩增，则：①子代DNA分子中等长链的DNA分子数为

个；

②子代DNA分子中不等长链的DNA分子数为

个；

③子代DNA分子中含模板链DNA分子数为

个；

④子代DNA分子中含引物1(或2)的DNA分子数为

个；

⑤复制过程中共需引物

个；⑥第n次复制需要引物

个。

(2n－2n)2n2(2n－1)(2n＋1－2)2n(2)已知引物1及引物2之间的序列为目的序列，若引物与DNA的结合位点如图所示，在第

轮循环产物中开始出现两条单链等长的目的片段。

3热点2

PCR技术中限制酶和启动子的选择1.单酶切和双酶切 (1)单酶切(2)双酶切①过程：利用____________________目的基因和载体，使目的基因和载体均具有____________________，就可以避免反接，并减少自身环化的情况。优点两个不同限制酶切割两个不同的黏性末端②方向：插入位置前后分别要有启动子和终止子，保证目的基因的表达。[例1]

(2024·重庆卷，19节选)大豆是重要的粮油作物，提高大豆产量是我国农业领域的重要任务。我国研究人员发现，基因S在大豆品种DN(种子较大)中的表达量高于品种TL(种子较小)，然后克隆了该基因(两品种中基因S序列无差异)及其上游的启动子序列，并开展相关研究。 ①表达载体

限制酶识别位点(HindⅢ，SpeⅠ，EcoRⅠ，XbaⅠ)②启动子D＋基因S5′……TAGAATTCCA……3′3′……ATCTTAAGGT……5′③四种限制酶识别序列及切割位点注：箭头表示酶的切割位置。通过基因工程方法，将DN克隆的“启动子D＋基因S”序列导入无基因S的优质大豆品种YZ。根据题图所示信息(不考虑未标明序列)判断构建重组表达载体时，为保证目标序列的完整性，不宜使用的限制酶是

；此外，不宜同时选用酶SpeⅠ和XbaⅠ，原因是______________________________________________________________________________________________________________。EcoRⅠ

酶切后形成的片段黏性末端相同，易自身环化；不能保证目标片段与载体定向连接解析根据图示信息可知，“启动子D＋基因S”的DNA序列上存在EcoRⅠ的识别序列，若使用限制酶EcoRⅠ，会使目的基因序列被破坏；根据图中限制酶的识别序列可知，酶SpeⅠ和XbaⅠ切割产生的黏性末端相同，若用这两种限制酶切割，形成的DNA片段在构建基因表达载体时，容易出现自我环化，以及无法保证目的基因片段与载体片段定向连接，影响目的基因在受体细胞中的表达。[例2]

(2022·湖北卷，24节选)如图是S基因的cDNA和载体的限制性内切核酸酶酶谱。为了成功构建重组表达载体，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用

酶切割S基因的cDNA和载体。Xba

Ⅰ、HindⅢ解析为了成功构建重组表达载体，不破坏载体关键结构和目的基因，确保目的基因插入载体中方向正确，最好选用Xba

Ⅰ、HindⅢ酶切割S基因的cDNA和载体。2.启动子的选择 (1)启动子的类型(2)乳腺生物反应器、膀胱生物反应器与植物反应器[例3]

(2024·河北卷，22节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。

回答下列问题：

实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为

启动子。Nos为终止子，其作用为

。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶

和

对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。在胚乳中特异性表达的基因终止转录HindⅢEcoRⅠ解析若使r2HN仅在水稻胚乳中表达，则GtP应为在胚乳中特异性表达的基因启动子。终止子是基因下游的一段有