CN116478894B 一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法 （江南大学）

oligosaccharides,3'-sialyl一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及本发明公开了一种提高唾液酸乳糖产量的2并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N一乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基所述UDP乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺6磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合所述α2,3唾液酸转移酶基因选自多杀性巴氏杆菌Pasteurellamultocida的基因突编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因所述乳糖转移酶编码基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺6磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU的核苷酸序列分别如SEQIDNO.7～SEQIDNO.9所所述基因突变体Pm0188*的核苷酸序列如SEQIDNO.1并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N一乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基所述UDP乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺所述α2,6唾液酸转移酶基因选自鳆发光杆菌Photobacteriumleiognathi的基因突glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因gl3所述乳糖转移酶编码基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO.所述葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU的核苷酸序列分别如SEQIDNO:8～SEQIDN所述谷氨酰胺合成酶编码基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO:1所述基因突变体plst6*的核苷酸序列如SEQIDNO.1编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因所述α2,3唾液酸转移酶基因选自多杀性巴氏杆菌Pasteurellamultocida的基因突所述基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺6磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU的核苷酸序列分别如SEQIDNO:7～所述基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；所述基因突变体Pm0188*的核苷酸glmM和UDP乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因gl所述α2,6唾液酸转移酶基因选自鳆发光杆菌Photobacteriumleiognathi的基因突所述基因lacY的核苷酸序列如SEQIDNO:所述葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和UDP一乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU的所述基因glnA的核苷酸序列如SEQIDNO.1所述基因突变体plst6*的核苷酸序列如SEQIDNO.146.权利要求1或2所述基因工程菌，或权利要求3_5任一项所述的方法在生产唾液酸乳糖及含有唾液酸乳糖的产品中的应用。5过调节肠—脑轴支持正常的微生物群落和应激期间的行为反应。因此采用母乳喂养的婴[0004]目前关于生物发酵制备唾液酸乳糖，以2008年EricSamain等通过敲除nanT、2010年该课题组以同样方法构建6'_SL路径，仅将3'_SL从头合成路径中的α_2,3唾液酸转6[0010]在一种实施方式中，所述UDP_乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺_6_磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和/或UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因果糖激酶编码基因pfkA和/或葡萄糖胺_6磷酸脱氨酶编码萄糖胺合成酶基因glmM、UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因glmU和谷氨酰胺合成酶基因[0019]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0020]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0021]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0022]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0023]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0024]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0025]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pRSFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0026]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、7[0027]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0028]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0029]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pCDFDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0038]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0039]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0040]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0041]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0042]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0043]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、8[0044]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、[0052]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet_1质粒表达基因neuB、neuC、neuA和glnA，利用pCOLADuet_1质粒表达基因lacY、α_2,6唾液酸转移酶基因，利用[0054]在一种实施方式中，所述编码α_2,3唾液酸转移酶基因Pm0188、突变体基因Pm0188*、来源于海藻百伯坦菌Bibersteiniatrehalosi的基因[0055]在一种实施方式中，所述编码α_2,6唾液酸转移酶基因选自来源于光杆菌Photobacteriumsp.的基因pst6_224、来源于鳆发光杆菌Photobacteriumleiognathi的基因plst6、突变体基因plst6*来源于美人鱼发光杆菌Photobacteriumdamselae的基因9萄糖胺焦磷酸化酶基因glmU和谷氨酰胺合成酶基因gln1过表达葡萄糖胺_6_磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和/或UDP_[0065]在一种实施方式中，利用pETDuet_1或pACYCDuet_1过表达neuB基因、neuC基因、neuA基因和基因glnA，利用pRSFDuet_1或pCOLADuet_1过表达基因lacY和编码唾液酸转移码基因glmM和/或UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因gl[0069]在一种实施方式中，待初始碳源消耗完后，流加600～850g/L甘油和15～25g/酸乳糖及含有唾液酸乳糖的产品中的应用。[0075]本发明通过乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N一乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、CMP唾液酸合成酶基因neuA、α2,3唾液酸转移酶基因lst和/或α2,6唾液酸转移酶基因同时，通过表达基因glnA(编码谷氨酰胺合成酶)建立谷氨酰胺循环调控前体物质葡萄糖[0088]HPLC检测条件：示差折光检测器；色谱柱为RezexROA_organicacid[0090]挑取LB固体培养基上过夜培养的工程菌菌落接种于5mLLB液体培养基中，37℃、200r/min下培养12h作为种子液。按照1％(v/v培养基中，37℃、200r/min下培养至菌体OD600值为0.6～0.8，加入IPTG使其终浓度为[0095]利用CRISPR_Cas9基因敲除系统敲除大肠杆菌BL21(DE3)基因组中lacZ、nanA、[0096](1)以E.coliBL21(DE3)基因组DNA为模板，利用引物对lacZ_up_F/R和lacZ_通过SOE_PCR技术将上下游片段扩增连接起来获得基因同源修复臂donor_lacZ、donor_[0097](2)以pTargetF质粒(Addgene:#62226)为模板，以lacZ_sg_F/R、nanA_sg_F/R、(即带有lacZ、nanA、pfkA和nagB特异性N20序列的靶向质粒pTargetF_lacZ、pTargetF_[0098](3)冰上放置E.coliBL21(DE3)感受态细胞解冻10min，取5μLpCas质粒于冰上2～3min。加入1mL新鲜LB液体培养基，30℃、200r/min培养1h后，3500r/min离心养至长出E.coliBL21(DE3)[0100](5)将pTargetF_lacZ质粒(总量500ng)和基因同源修复臂donor_lacZ(总量1μg)[0101](6)将步骤(5)测序验证敲除成功的阳性克隆菌落培养于含有卡那霉素的LB液体股份有限公司合成来源于空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni的neuB、neuC、neuA基因序列，来源于脑膜炎奈瑟球菌Neisseriameningitidis的lst基因序列，来源于光杆菌Photobacteriumsp.的pst6_224基因序列。[0113]以合成的pst6_224基因片段为模板，以pst6_224_F/pst6_224_R为引物扩增出(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到质粒pRS_lst和pRS_pst6的NdeI/XhoI酶切位[0118](3)根据唾液酸乳糖代谢合成路径中的关键基因将步骤(1)获得的质粒pET_BCA和[0121]模块的表达量值由启动子的力度和质粒拷贝数共同决定。本实施例使用的5个质基因片段neuA分别连接到质粒pRS_BC、pCD_BC、pAC_BC和pCO_BC的NdeI/XhoI酶切位点之[0123]利用实施例2的构建方法将基因片段lst和pst6_224分别连接到载体pETDuet_1、[0124]以CMP_唾液酸为模块化节点，将代谢合成途径分为两个模块，模块上游基因为程菌(即菌株BC1)和含有重组质粒pAC_BCA和pCO_PY的工程菌(即菌株BK15)分别获得了NanT酶可逆运输。乙酰甘露糖胺和唾液酸的可用性对唾液酸乳糖的合成效率存在一定影合成酶)和glmU(编码UDP_乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶)，在UDP_乙酰葡糖胺的产生中是至关构建方法将回收的glmS、glmM和glmU基因片段通过无缝克隆试剂盒(南京诺唯赞生命科技有限公司)分别连接到载体pCDFDuet_1的NcoI/BamHI酶切位点之间，获得质粒pCD_glmS、[0134]以大肠杆菌BL21(DE3)Δ(DE3)ΔlacZΔnanAΔpfkAΔnagB。将实施例4中的质粒组合分别转化至敲除菌株BL21Pst6_224(蛋白质ID：BAF92026.1)，Plst6(蛋白质ID：BAI49484.1)和Bst(蛋白质ID：BAA25316.1)及其突变体PM0188*(R313N/T265S)、Nst*(I411T/L433T)、Plst6*(ΔN2_15生工生物工程(上海)股份有限公司合成来源于多杀性巴氏杆Pm0188和Pm0188*基因序列，来源于海藻百伯坦菌Bibersteiniatrehalosi的WQG基因序Photobacteriumleiognathi的plst6和plst6*基因序列以及