棱状杆菌肽酶A软膏标准H20010136

PAGEPAGE5H20010136梭菌肽酶A软膏SuojuntaimeiARuangaoClostridiopeptidaseAOintment爱疗素（IruxolMono）本品含梭状杆菌肽酶A活性不得低于1.2u/g，蛋白酶活性不得低于0.24u/g。[性状]本品为淡棕色软膏，内含微小棕色颗粒，微有特殊气味。[鉴别]同含量测定项，本品具有梭状杆菌肽酶A的专属活性。取本品约1g，置一三角瓶中，加入石油醚10ml，振摇使溶解；加入0.1mol/L醋酸钙溶液10ml，置振荡器上振荡30分钟后，移入分液漏斗中静置分层。取水相3.0ml，加入3%茚三酮的乙二醇单甲醚溶液（临用前配制）1ml。将溶液置沸水浴加热5分钟，溶液即显蓝紫色。[检查]微生物限度照中国药典2000年版二部附录XIJ检查，需气菌≤10²，大肠杆菌，绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌不得检出。其它应符合软膏剂项下有关的各项规定（中国药典2000年版二部附录IF）。[含量测定]梭状杆菌肽酶A活性测定校正溶液的制备：精密称取glycyl-prolyl-alanine约15.2mg于250ml容量瓶中，用tris缓冲液（称取6.05gtris，15.82g醋酸钙，加水溶解，用0.1mol/L盐酸液调pH至7.2，定容至1000ml。）溶解并稀释至刻度（临用前配制）。取四支试管，每支中分别加入校正溶液o.5ml，Rosen缓冲液（称取10mg氰化钾，360g醋酸钠，加适量水溶解后，加入66.5ml冰醋酸，用水定容至1000ml。使用前一周配制，冰箱保存。）0.5ml和蒸馏水0.5ml，标签为“ST”。冰浴中保存待用。样品溶液的制备：精密称取本品约3.7g于具磨口塞的100ml三角瓶中，加入石油醚30ml，置搅拌器上以200转/分的转速搅拌1小时，然后加入0.01mol/L醋酸钙溶液10.0ml为提取剂，继续搅拌20分钟后，转移至50ml分液漏斗中，静置，取水相为供试品溶液。（此溶液应在3小时之内使用）。每批样品称取两份，标签为“S1”和“S2”。样品的称取量应使样品液和校正液在茚三酮反应后，样品管的吸收值在校正液管的吸收值的±20%以内。参照液：取四支试管，每支中分别加入tris缓冲液0.5ml，Rosen缓冲液0.5ml和蒸馏水0.5ml，标签为“STBW”。冰浴中保存待用。取16支试管，4支标签为“I”，4支标签为“IBW”，用于“S1”的测定；4支标签为“II”，4支标签为“IIBW”，用于“S2”的测定。在8支标签为“I”和“II”的试管中，分别加入六肽溶液（称取六肽50mg，用tris缓冲液溶解并稀释至50.0ml，新鲜配制）1.95ml；在8支标签为“IBW”和“IIBW”的试管中，分别加入tris缓冲液1.95ml。按下列管号为序操作：I，I，I，I，IBW，IBW，IBW，IBW，II，II，II，II，和IIBW，IIBW，IIBW，IIBW。放入37˚c水浴中预热约3分钟。在标签为“I…”和标签为“IBW…”的试管中，加入50ul的“S1”液；在标签为“II…”和标签为“IIBW…”的试管中，加入50ul的“S2”液；加入后振摇混匀，每管间隔15秒。37˚c水浴中准确保温15分钟后，按顺序从每管中吸取o.5ml的反应液分别加入到含0.5ml的蒸馏水和0.5mlRosen缓冲液的试管中。冰浴保存。将上述试管按以下顺序分三组：ST，STBW，I，IBW，II，IIBW，ST，STBW；I，IBW，II，IIBW，ST，STBW，I，IBW；II，IIBW，ST，STBW，I，IBW，II，IIBW；将每组的8支试管放入沸水浴中3分钟，以精确的时间间隔加入0.5ml茚三酮溶液（称取0.75g茚三酮25mlEthyleneglycolmonomethylether，新鲜配制。），混匀后置沸水浴中继续反应15分钟，取出置冰浴中。待试管冷却后，加3.0ml50%乙醇溶液，混匀，以50%乙醇溶液为空白，在570nm处测定吸收值。计算：ST＋ST＋ST＋ST=XSTSTBW+STBW+STBW+STBW=XSTBW4I+I+I+I=XIIBW+IBW+IBW+IBW=XIBW4II+II+II+II=XIIIIBW+IIBW+IIBW+IIBW=XIIBW4XST–XSTBW=∆STXI–XIBW=∆IXII–XIIBW=∆II样品I液（S1）：ET•05ml•1000000•2ml•10ml•∆I=AprI243.26g/mol•250ml•15min•0.05ml•∆st•EprI样品II液（S2）：ET•05ml•1000000•2ml•10ml•∆II=AprII243.26g/mol•250ml•15min•0.05ml•∆st•EprII式中：ET=六肽的称重(g)EprI=样品I（S1）的称重（g）EprII=样品II（S2）的称重（g）AprI=样品I（S1）的活性（U/g）AprII=样品II（S2）的活性（U/g）蛋白酶活性测定：试剂：10mmol/L醋酸钙溶液；0.1mol/Ltris盐酸缓冲液：称取12.1gtris，用0.1mol/LHCL调节pH至7.50，加蒸馏水定容至100ml。5%(W/V)的三氯醋酸溶液；酪蛋白溶液：称取0.67g酪蛋白于100ml容量瓶中，加入约80ml0.1mol/Ltris-HCL缓冲液；置沸水浴中准确加热15分钟，至酪蛋白全部溶解；冷却至室温后，用0.1mol/Ltris-HCL缓冲液稀释并定容至100ml。新鲜配制。L-酪氨酸溶液：准确称取L-酪氨酸6.04g，加入100m15%三氯醋酸，搅拌1小时，使L-酪氨酸全部溶解。样品液制备：精密称取本品约1.5g于100ml具玻璃磨口塞三角瓶中，加入30ml石油醚，搅拌30分钟，使溶解。加入0.01mol/L醋酸钙溶液30.0ml，继续搅拌10分钟，置分液漏斗静置后，分取水相提取液，作为样品溶液。按下表操作：样品管样品空白管L-酪氨酸管L-酪氨酸空白管酪蛋白1.50ml1.50ml1.50ml1.50ml预恒温(35˚c)5min5min5min5min样品液0.5ml10mM醋酸钙--0.5ml0.5ml振摇混匀++++恒温（35˚c）20min三氯醋酸3.0ml3.0ml-3.0mlL-酪氨酸--3.0ml-振摇混匀++++样品液--0.5ml-振摇混匀-+--室温放置30分钟后，G4#沙芯漏斗过滤，于280nm处测定吸收值。计算：L-酪氨酸克分子吸收系数：∆ATyr×181.2mg/mmol∑=Mtyr×DFTyr式中：∆ATyr=酪氨酸溶液吸收度差值的均值（n=3）181.2=L-酪氨酸的克分子量以mg/mmol计Mtyr=L-酪氨酸的取样量DFTyr=L-酪氨酸的稀释因子（=6）蛋白酶的活性（U/g）