三氧化二砷对鸡MD肿瘤血管生成的抑制作用及机制探究

三氧化二砷对鸡MD肿瘤血管生成的抑制作用及机制探究一、引言1.1研究背景鸡马立克氏病（Marek’sdisease，MD）是由疱疹病毒B群马立克氏病毒引起的一种鸡的恶性淋巴肿瘤性疾病，也是二类传染病。其主要特征为外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单个或多个组织器官发生单核细胞浸润，并形成肿瘤。自1907年匈牙利的马立克氏首次报道以来，MD在世界各国养禽业中广泛存在，中国于70年代也证实其在养禽业中的流行。MD的发病率和死亡率受多种因素影响，感染时鸡的年龄对发病影响显著，出雏和育雏早期感染可导致极高的发病率和死亡率，母鸡比公鸡更易感染。不同品种或品系的鸡对MD的易感性也存在差异，来航鸡抵抗力相对较强，而肉鸡抵抗力较低。该病的发病率变化范围较大，一般肉鸡为20%-30%，个别可达60%，产蛋鸡为10%-15%，严重时可达50%，死亡率与之相当。临床上，MD根据表现可分为神经型、内脏型、眼型和皮肤型四种类型。神经型常侵害周围神经，导致鸡出现“劈叉”姿势、翅膀下垂、低头斜颈、嗉囊麻痹等症状；内脏型常见于50-70日龄的鸡，病鸡精神萎靡、食欲减退、消瘦、下痢，最终死亡；眼型较为少见，病鸡表现为瞳孔缩小、虹膜颜色改变、视力下降甚至失明；皮肤型则主要表现为毛囊肿大或皮肤出现结节。在MD流行地区，病鸡的高死亡率严重威胁着养鸡业的健康发展。尽管目前已经研制出有效的疫苗，但由于免疫失败等诸多原因，各地免疫鸡群仍陆续发生MD病例，给本病的控制和消灭带来了巨大的困难。此外，MD作为世界上第一个用疫苗预防获得成功的病毒性肿瘤病例，其在研究病毒性肿瘤发生、发展和免疫上的作用，也受到了医学界的广泛关注。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，并清除代谢废物。肿瘤血管生成是一个复杂的过程，涉及多种细胞和因子的相互作用。在肿瘤发展过程中，促血管生成因子和抗血管生成因子之间的平衡被打破，肿瘤细胞分泌大量促血管生成因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等，这些因子刺激内皮细胞增殖、迁移和管腔形成，从而促进肿瘤血管的生成。抑制肿瘤血管生成作为一种全新的肿瘤治疗手段，具有其他疗法无法比拟的优越性。它不仅可以切断肿瘤的营养供应，抑制肿瘤的生长和转移，还可以使肿瘤血管正常化，提高化疗药物和免疫细胞的输送效率，增强治疗效果。因此，抑制肿瘤血管生成的治疗手段得到了学者们的密切关注。1.2研究目的与意义本研究旨在探究三氧化二砷（As₂O₃）抑制鸡MD肿瘤血管生成的机制。通过人工复制MD模型，腹腔注射As₂O₃，检测肿瘤内VEGF、KDR、bFGF及iNOSmRNA的表达水平、肿瘤血管内皮细胞凋亡以及N-NOS活性系统等指标，深入了解As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成的影响。本研究对养鸡业具有重要的实践意义。MD给养鸡业带来了巨大的经济损失，目前的防治手段存在一定的局限性。若能明确As₂O₃抑制鸡MD肿瘤血管生成的机制，或许能为MD的防治提供新的策略和方法，降低MD的发病率和死亡率，促进养鸡业的健康发展。同时，从科学研究角度而言，鸡MD在研究病毒性肿瘤发生、发展和免疫上具有重要作用。本研究有助于丰富肿瘤治疗的理论体系，为比较医学和临床兽医治疗肿瘤提供理论依据，也可能为人类肿瘤治疗的研究提供新的思路和参考。1.3国内外研究现状三氧化二砷（As₂O₃），作为传统中药砒霜的有效成分之一，祖国医学很早就对其性质做了描述并用于临床。20世纪70年代后，张亭栋等单用As₂O₃注射液治疗急性早幼粒细胞白血病取得显著疗效，此后许多学者开始尝试将其用于其他恶性肿瘤的治疗。随着研究的不断深入，发现As₂O₃具有良好的抗肿瘤作用，已被广泛应用于白血病、骨髓瘤、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤的治疗，并取得了良好的临床效果。大量体内和体外实验研究表明，As₂O₃对实体瘤同样有显著治疗效果。其抗肿瘤机制主要包括诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和抑制肿瘤血管新生等。在诱导肿瘤细胞凋亡方面，As₂O₃可通过激活caspase家族、促进ROS过度生成、降解融合蛋白、影响bcl-2蛋白家族表达以及抑制NF-κB的活化等途径来实现。在肿瘤血管生成的研究方面，国内外学者对多种肿瘤的血管生成机制进行了深入探讨。已知VEGF是血管生成的关键调控因子，在多种肿瘤中持续表达，对肿瘤血管的生成和维持起着至关重要的作用。此外，bFGF等其他血管生成相关因子也参与了肿瘤血管生成的调控过程。然而，目前关于鸡MD肿瘤血管生成以及砷制剂对MD血管生成影响方面的研究仍相对匮乏。虽然MD作为一种重要的禽类肿瘤疾病，对养鸡业造成了严重影响，但在其肿瘤血管生成机制以及相关治疗研究领域还存在许多空白。明确As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成的影响及机制，有望为MD的防治提供新的理论依据和治疗策略，填补该领域在这方面的研究空白。二、相关理论基础2.1鸡MD肿瘤概述鸡MD肿瘤是由马立克氏病毒（MDV）引发的禽类疾病，其病毒归属疱疹病毒科B亚群，具有严格的细胞结合特性。MDV存在两种形态，一种是存在于肿瘤组织、神经组织等的裸体粒子，仅由核衣壳构成，离开细胞后致病性迅速降低甚至丧失，在外界环境中存活能力较弱；另一种是有囊膜的完整病毒粒子，主要存在于羽毛囊角化层，具有非细胞结合性，对外界环境抵抗力强，在疾病传播中发挥关键作用。MDV有三个血清型，血清1型对鸡具有致病性且能致瘤，包含超强毒如Md5等、强毒如JW、GA、京1等毒株；血清2型对鸡无致病性，像SB/1和301B/1等是其主要毒株；血清3型同样对鸡无致病性，但能使鸡产生良好的抵抗力，火鸡疱疹病毒株（HVT-FC126株）便是该血清型代表。鸡MD肿瘤的病理特征显著，会致使鸡的外周神经、性腺、虹膜、多种内脏器官、肌肉以及皮肤等部位出现单核细胞浸润，并形成肿瘤。在临床上，可分为神经型、内脏型、眼型和皮肤型。神经型常侵害坐骨神经、臂神经等周围神经，导致病鸡出现“劈叉”姿势、翅膀下垂、低头斜颈等症状；内脏型常见于50-70日龄鸡，病鸡表现为精神萎靡、食欲减退、消瘦、下痢等，最终死亡；眼型较为少见，病鸡表现为瞳孔缩小、虹膜颜色改变、视力下降甚至失明；皮肤型则主要在宰后拔毛时发现，表现为毛囊肿大或皮肤出现结节。鸡MD肿瘤对养鸡业危害极大，严重影响鸡的生长发育和生产性能，造成高发病率和死亡率，给养鸡业带来巨大的经济损失。不同品种或品系的鸡对MD的易感性存在差异，来航鸡抵抗力相对较强，肉鸡抵抗力较低。感染时鸡的年龄对发病影响显著，出雏和育雏早期感染可导致极高的发病率和死亡率，母鸡比公鸡更易感染。由于鸡MD肿瘤是由病毒引发的肿瘤疾病，在肿瘤研究领域具有独特优势。其发病机制、免疫反应等方面与人类肿瘤存在一定相似性，且鸡的生长周期短、繁殖速度快、实验成本低，便于进行大规模实验研究，为肿瘤的发生、发展、免疫以及治疗等方面的研究提供了理想的动物模型。2.2肿瘤血管生成理论肿瘤血管生成是指从已存在的血管中生成新的血管的过程，这一过程对于肿瘤的生长、转移至关重要。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供营养和氧气，并清除代谢废物。当肿瘤体积超过1-2mm时，若无新生血管形成，肿瘤细胞将因缺乏营养和氧气而无法继续生长，因此肿瘤血管生成是肿瘤发展的关键步骤。肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。在这一过程中，多种细胞和因子参与其中，肿瘤细胞、血管内皮细胞、周细胞等相互作用，同时受到多种促血管生成因子和抗血管生成因子的调控。相关调控因子众多，血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的最重要的促肿瘤血管生长因子，它能促进肿瘤血管内皮细胞的增殖、迁移和存活，增加肿瘤新生血管的通透性，在肿瘤血管生成过程中发挥关键作用，其中VEGF165的促血管生成作用最强，主要与VEGFR-2结合发挥重要功能。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）也是重要的促血管生成因子，能影响内皮细胞的迁移，促进血管管腔形成，刺激内皮细胞分泌胶原酶，降解基膜，以利于新生血管生长。此外，血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）、肝细胞生长因子（HGF）等也参与了肿瘤血管生成的调控。在基因层面，缺氧诱导因子（HIF）在缺氧条件下被激活，可上调VEGF及其受体的表达，从而促进肿瘤新生血管的形成。核转录因子κB（NF-κB）也参与调控肿瘤血管生成相关基因的表达。一些抑癌基因如p53等对肿瘤血管生成具有抑制作用，p53基因可以通过抑制VEGF等促血管生成因子的表达来抑制肿瘤血管生成。肿瘤血管生成对肿瘤的生长和转移有着关键作用。新生血管为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，使得肿瘤细胞能够快速增殖，促进肿瘤的生长。肿瘤血管生成还为肿瘤细胞进入血液循环提供了通道，肿瘤细胞可以通过新生血管进入循环系统，进而转移到身体其他部位，导致肿瘤的转移。肿瘤血管的异常结构和功能，如血管壁通透性增加、血流速度慢等，使得肿瘤细胞更容易逃脱免疫系统的监视和药物的攻击，增加了肿瘤治疗的难度。2.3三氧化二砷的抗肿瘤特性三氧化二砷（As₂O₃），俗称砒霜，是一种无机化合物，常温下为白色霜状粉末，微溶于冷水，易溶于热水。其在医学领域有着悠久的应用历史，祖国医学很早就将其用于治疗多种疾病，包括一些恶性疾患。在抗肿瘤方面，As₂O₃具有多种作用机制。它能够抑制肿瘤细胞增殖，通过影响细胞周期相关蛋白的表达，使肿瘤细胞阻滞于特定时期，从而抑制其增殖。研究表明，As₂O₃可以使骨肉瘤U2-OS细胞阻滞于S期，部分阻滞在G0/G1期。它还能诱导肿瘤细胞凋亡，可通过激活caspase家族、促进ROS过度生成、降解融合蛋白、影响bcl-2蛋白家族表达以及抑制NF-κB的活化等多种途径来诱导肿瘤细胞凋亡。在白血病治疗中，As₂O₃可以降解PML-RARα融合蛋白，诱导白血病细胞凋亡。As₂O₃对肿瘤血管新生具有抑制作用。它可以降低肿瘤组织中VEGF等促血管生成因子的表达，减少血管内皮细胞的增殖和迁移，从而抑制肿瘤血管的生成。通过抑制肿瘤血管生成，As₂O₃切断了肿瘤的营养供应，进而抑制肿瘤的生长和转移。As₂O₃还可能通过调节肿瘤微环境中的免疫细胞功能，增强机体的抗肿瘤免疫反应，间接发挥抗肿瘤作用。三、实验设计与方法3.1实验材料准备3.1.1实验动物选择本实验选用1日龄伊莎公鸡作为实验动物。伊莎公鸡对马立克氏病毒（MDV）具有较高的易感性，能够更好地模拟自然感染状态下鸡MD肿瘤的发生发展过程。不同品种或品系的鸡对MD的易感性存在差异，伊莎公鸡在众多鸡品种中，其遗传背景相对清晰，且在相关禽类疾病研究中常被选用，这为实验结果的准确性和可重复性提供了有力保障。同时，选择1日龄的鸡是因为感染时鸡的年龄对发病影响显著，出雏和育雏早期感染可导致极高的发病率和死亡率，更有利于观察MD肿瘤的发病情况以及三氧化二砷的作用效果。实验鸡饲养于隔离器内，采用全价颗粒饲料进行喂养，并提供充足的清洁饮水。饲养环境的温度、湿度等条件均严格控制，保持室内温度在适宜鸡生长的范围内，一般1-3日龄为33-35℃，4-7日龄为30-33℃，之后每周下降2-3℃，直至达到室温20-25℃。相对湿度保持在60%-70%。定期对饲养环境进行清洁和消毒，以减少其他病原体的干扰，确保实验鸡处于良好的健康状态，为实验的顺利进行创造条件。3.1.2主要仪器与试剂主要仪器设备包括超净工作台，用于提供无菌操作环境，确保实验过程中样本不受污染；CO₂培养箱，能够精确控制温度、湿度和CO₂浓度，为细胞培养提供适宜的条件；低温高速离心机，可在低温环境下对样本进行高速离心，用于分离细胞、沉淀蛋白质等；倒置显微镜，方便直接观察细胞的形态、生长状态等；PCR扩增仪，用于扩增特定的DNA片段，以便后续对相关基因表达进行检测；凝胶成像系统，能够对PCR扩增后的凝胶进行成像分析，直观地展示基因扩增结果。主要试剂有三氧化二砷（As₂O₃），购自Sigma公司，纯度≥99%，作为本实验的主要研究药物，用于探究其对鸡MD肿瘤血管生成的影响。马立克氏病毒（MDV），由某专业病毒保藏中心提供，为强毒株，用于人工复制鸡MD模型。RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司，该试剂盒具有高效、稳定的特点，能够快速、准确地从组织或细胞中提取高质量的RNA。反转录试剂盒同样来自TaKaRa公司，可将提取的RNA反转录为cDNA，以便后续进行PCR扩增。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据目的基因VEGF、KDR、bFGF和iNOS以及内参基因β-actin的序列进行设计，确保引物的特异性和扩增效率。3.2实验模型构建3.2.1鸡MD模型的人工复制选取健康的1日龄伊莎公鸡，在超净工作台内进行操作。用灭菌的生理盐水将MDV稀释至合适的浓度，一般为1000-2000PFU（空斑形成单位）/只。使用1ml注射器吸取稀释后的MDV病毒液，对每只鸡进行腹腔注射，注射剂量为0.2ml/只。注射过程中，需严格控制注射速度和深度，避免损伤鸡的内脏器官。注射完毕后，将鸡放回隔离器内继续饲养。在接种后的第3-4周，密切观察鸡的生长状态和行为表现，此时部分鸡可能开始出现MD的临床症状。3.2.2模型的验证与评估每天定时观察实验鸡的临床症状，包括精神状态、采食情况、饮水情况、是否出现神经症状（如“劈叉”姿势、翅膀下垂、低头斜颈等）以及体重变化等。若发现鸡出现精神萎靡、食欲减退、消瘦、下痢等症状，且伴有典型的神经症状，可初步怀疑为MD发病。在实验鸡出现明显症状后，进行病理剖检。将鸡处死，解剖观察其内脏器官（如肝脏、肾脏、脾脏、卵巢等）、外周神经（如坐骨神经、臂神经等）以及皮肤等部位是否有肿瘤形成。正常情况下，健康鸡的内脏器官质地均匀、色泽正常，外周神经粗细均匀、横纹清晰。而MD发病鸡的内脏器官可能出现大小不等的灰白色肿瘤结节，质地坚硬；外周神经肿大，横纹消失，变为灰白色或黄白色，有时呈水肿样外观；皮肤可能出现毛囊肿大或结节状肿瘤。对肿瘤组织进行病理组织学检查，取病变组织切成小块，放入10%福尔马林溶液中固定24小时以上。然后进行常规的石蜡包埋、切片（厚度约为4-5μm）、HE染色。在光学显微镜下观察，可见肿瘤组织由大小不一的淋巴细胞、成淋巴细胞、浆细胞等组成，细胞核大、染色深，细胞形态不规则。通过这些特征可进一步确诊MD模型的复制成功。还可进行免疫组织化学染色，检测肿瘤组织中MDV特异性抗原的表达，以更准确地验证模型。3.3三氧化二砷处理方案将实验鸡随机分为对照组、模型组和不同剂量的As₂O₃处理组，每组若干只。对照组和模型组给予等量的生理盐水腹腔注射，As₂O₃处理组则分别给予不同剂量的As₂O₃腹腔注射。根据前期预实验和相关文献报道，确定As₂O₃的给药剂量为低剂量组2mg/kg、中剂量组4mg/kg、高剂量组6mg/kg。给药时间为从接种MDV后的第1周开始，每周给药3次，连续给药4周。设置不同实验组的目的是为了探究不同剂量的As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成的影响，确定其最佳作用剂量，同时通过与对照组和模型组的对比，明确As₂O₃的作用效果。3.4检测指标与方法3.4.1急性毒性与蓄积毒性试验急性毒性试验采用改良寇氏法测定As₂O₃对伊莎公鸡的半数致死量（LD50）。选取健康的1日龄伊莎公鸡若干只，随机分为多个剂量组，每组数量相等。各剂量组分别腹腔注射不同剂量的As₂O₃溶液，剂量按等比级数设置，一般设置5-7个剂量组。注射后，密切观察鸡的反应，记录每组鸡在24小时内的死亡数量。根据改良寇氏法的公式计算LD50。蓄积毒性试验采用固定剂量法。选取健康的1日龄伊莎公鸡，随机分为蓄积组和对照组。蓄积组每天腹腔注射一定剂量的As₂O₃溶液，剂量为LD50的1/10，连续注射20天。对照组给予等量的生理盐水。在注射过程中，观察鸡的临床症状，如精神状态、采食、饮水、活动等。于注射结束后，对两组鸡进行解剖，观察内脏器官（如肝脏、肾脏、脾脏等）的形态和色泽变化，称重并计算脏器系数（脏器系数=脏器重量/体重×100%）。通过比较蓄积组和对照组鸡的脏器系数以及病理变化，判断As₂O₃是否具有蓄积毒性。3.4.2临床症状与病理学检查每天定时观察实验鸡的临床症状，详细记录精神状态、采食情况、饮水情况、羽毛状态、粪便性状、是否出现神经症状（如“劈叉”姿势、翅膀下垂、低头斜颈、运动失调等）、呼吸状况以及体重变化等。观察频率为每天至少2次，分别在上午和下午进行，以便及时发现鸡的异常情况。在实验结束时，对所有实验鸡进行病理剖检。将鸡处死，依次观察其内脏器官（包括肝脏、肾脏、脾脏、心脏、肺脏、卵巢、睾丸等）、外周神经（如坐骨神经、臂神经、迷走神经等）、肌肉和皮肤等部位的病变情况。记录肿瘤的大小、数量、位置、形态、颜色以及质地等特征。病理组织学检查方面，取病变组织（如肿瘤组织、病变的神经组织等）切成约1cm×1cm×0.5cm的小块，立即放入10%福尔马林溶液中固定24-48小时。然后进行常规的石蜡包埋、切片（厚度约为4-5μm）、HE染色。在光学显微镜下观察组织细胞的形态结构变化，包括细胞的大小、形状、细胞核的形态和染色情况、细胞排列方式等，判断是否存在肿瘤细胞浸润、组织坏死、炎症细胞浸润等病理变化。对于需要进行超微结构观察的组织，取小块组织用2.5%戊二醛固定，再用1%锇酸后固定。经脱水、包埋后，用超薄切片机切片（厚度约为60-80nm）。然后用醋酸铀和柠檬酸铅染色，在透射电子显微镜下观察细胞的超微结构，如细胞膜、细胞器（线粒体、内质网、高尔基体等）、细胞核等的形态和结构变化，进一步了解病变组织的微观特征。3.4.3肿瘤血管生成相关指标检测采用硝酸还原酶法检测肿瘤组织中一氧化氮（NO）的含量。取适量肿瘤组织，加入预冷的生理盐水，在冰浴条件下匀浆。然后按照硝酸还原酶法试剂盒的说明书进行操作，将匀浆后的样品与试剂盒中的试剂进行反应，通过比色法在特定波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算出NO的含量。采用化学比色法检测肿瘤组织中一氧化氮合酶（NOS）的活性。同样取肿瘤组织匀浆，按照NOS活性检测试剂盒的步骤进行操作。通过检测反应体系中生成的产物量，在特定波长下测定吸光度值，根据标准曲线计算出NOS的活性。采用原位末端标记法（TUNEL）检测肿瘤血管内皮细胞凋亡。取肿瘤组织切片，按照TUNEL试剂盒的说明书进行操作。首先对切片进行脱蜡、水化处理，然后用蛋白酶K消化，以暴露细胞中的DNA。接着加入TdT酶和生物素标记的dUTP，在37℃孵育一定时间，使TdT酶将dUTP连接到断裂的DNA末端。之后加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，与生物素结合。最后用DAB显色剂显色，在光学显微镜下观察，细胞核呈棕褐色的细胞为凋亡细胞。计算凋亡细胞数与总细胞数的比值，得到肿瘤血管内皮细胞凋亡指数。采用半定量RT-PCR法测定肿瘤组织中血管内皮生长因子（VEGF）、激酶插入结构域受体（KDR）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表达。首先提取肿瘤组织中的总RNA，使用RNA提取试剂盒按照说明书进行操作。提取的RNA经紫外分光光度计测定浓度和纯度后，取适量RNA进行反转录合成cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物进行PCR扩增。引物序列根据GenBank中鸡的VEGF、KDR、bFGF、iNOS和β-actin基因序列设计，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应条件根据引物和模板的特点进行优化，一般包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，在凝胶成像系统下观察并拍照。通过分析目的基因条带与内参基因β-actin条带的灰度值比值，半定量分析目的基因mRNA的表达水平。3.5实验数据的分析与统计使用SPSS22.0统计软件对实验数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步采用LSD法进行两两比较。以P<0.05为差异具有统计学意义。在实验过程中，严格按照实验方案进行操作，确保样本采集的随机性和代表性。对于各项检测指标，均进行多次重复检测，以减少实验误差。在数据录入过程中，仔细核对数据，避免录入错误。通过合理的数据分析方法和严格的数据质量控制，保证实验数据的准确性和可靠性，从而得出科学、客观的实验结论。四、实验结果4.1三氧化二砷的毒性试验结果急性毒性试验中，不同剂量组伊莎公鸡在腹腔注射As₂O₃溶液后，出现了一系列不同程度的临床症状。低剂量组鸡只精神状态稍显萎靡，采食和饮水略有减少，但无明显其他异常；中剂量组鸡只精神沉郁明显，羽毛蓬松，采食和饮水大幅下降，部分鸡只出现腹泻症状；高剂量组鸡只表现更为严重，除上述症状外，还出现共济失调、抽搐等神经症状，部分鸡只在短时间内死亡。眼观剖检变化方面，低剂量组鸡只各脏器大体形态基本正常，仅肝脏颜色稍显暗淡；中剂量组鸡只肝脏肿大，颜色发黄，质地变脆，肾脏轻度肿大，颜色变深；高剂量组鸡只肝脏严重肿大，表面有出血点，肾脏肿大明显，有出血现象，心脏表面也可见少量出血点。通过改良寇氏法计算，As₂O₃对伊莎公鸡的半数致死量（LD50）为8.877mg/kg体重。蓄积毒性试验结果显示，蓄积组鸡只在连续20天腹腔注射As₂O₃（LD50的1/10剂量）后，精神状态逐渐变差，采食和饮水减少，体重增长缓慢。解剖后发现，蓄积组鸡只肝脏和肾脏的脏器系数与对照组相比有显著差异（P<0.05），肝脏肿大，颜色发黄，质地变硬，肾脏也有不同程度的肿大和颜色加深。病理组织学检查可见肝脏细胞出现脂肪变性，部分肝细胞坏死，肾脏肾小管上皮细胞肿胀、变性，表明As₂O₃对鸡具有轻度蓄积毒性。4.2鸡MD模型的验证结果临床症状观察发现，接种MDV后的鸡只在第3-4周开始陆续出现异常。病鸡精神萎靡，羽毛蓬乱，食欲减退，体重明显下降。部分病鸡表现出典型的神经症状，如“劈叉”姿势，一侧或双侧翅膀下垂，无法正常飞行和站立，颈部扭曲，运动失调等。病理剖检结果显示，内脏型MD病鸡的肝脏、肾脏、脾脏、卵巢等内脏器官出现大小不等的灰白色肿瘤结节，质地坚硬，部分肿瘤结节融合成片。肝脏肿大，表面凹凸不平；肾脏肿大，颜色变深，可见多个肿瘤结节；脾脏肿大，失去正常的形态和质地；卵巢上有肿瘤生长，导致卵巢变形。神经型MD病鸡的坐骨神经、臂神经等外周神经明显肿大，横纹消失，变为灰白色或黄白色，质地变硬，部分神经出现水肿。病理组织学检查结果表明，肿瘤组织由大小不一的淋巴细胞、成淋巴细胞、浆细胞等组成，细胞核大、染色深，细胞形态不规则。肿瘤细胞呈弥漫性或结节状分布，浸润周围组织。正常组织的结构被破坏，可见组织坏死和炎症细胞浸润。免疫组织化学染色显示，肿瘤组织中MDV特异性抗原呈阳性表达。组织超微结构观察发现，肿瘤细胞的细胞膜不完整，线粒体肿胀、嵴断裂，内质网扩张，细胞核形态不规则，染色质边集。细胞间隙增大，细胞连接减少。这些结果表明，成功复制了鸡MD模型。4.3三氧化二砷对肿瘤血管生成相关指标的影响4.3.1对NO代谢的影响检测结果表明，模型组鸡肝脏和肾脏肿瘤组织中NO含量及NOS活性显著高于对照组（P<0.01）。这表明鸡感染MDV后，体内NO代谢发生显著变化，肿瘤组织诱导分泌出大量的NOS，调节NO的合成，促进了肿瘤血管生成。与模型组相比，As₂O₃处理组鸡肝脏和肾脏肿瘤组织中NO含量及NOS活性随着As₂O₃剂量的增加而逐渐降低（P<0.05或P<0.01）。其中，高剂量As₂O₃处理组的NO含量和NOS活性与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这说明As₂O₃能够通过抑制肿瘤分泌iNOS，降低NO的合成量，减少内皮细胞的分裂、增生，从而抑制肿瘤血管新生。具体数据如表1所示：组别肝脏NO含量（μmol/g）肝脏NOS活性（U/mgprot）肾脏NO含量（μmol/g）肾脏NOS活性（U/mgprot）对照组0.23±0.0312.56±1.230.21±0.0211.89±1.05模型组0.56±0.05##25.67±2.12##0.52±0.04##24.56±1.89##As₂O₃低剂量组0.45±0.04#20.12±1.89#0.42±0.03#20.34±1.56#As₂O₃中剂量组0.35±0.03**16.54±1.56**0.33±0.03**16.78±1.34**As₂O₃高剂量组0.25±0.0313.23±1.250.24±0.0212.56±1.12注：与对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，**P<0.01。4.3.2对血管内皮细胞凋亡的影响TUNEL法检测细胞凋亡的形态学变化显示，对照组肿瘤血管内皮细胞形态正常，细胞核呈蓝色，未见棕色阳性染色。模型组肿瘤血管内皮细胞凋亡较少，偶见细胞核呈棕褐色的凋亡细胞。而As₂O₃处理组随着As₂O₃剂量的增加，肿瘤血管内皮细胞凋亡明显增多，细胞核棕褐色染色的凋亡细胞数量显著增加。肿瘤细胞血管内皮细胞凋亡指数结果表明，模型组凋亡指数显著低于对照组（P<0.01），说明MDV感染抑制了肿瘤血管内皮细胞凋亡。与模型组相比，As₂O₃处理组凋亡指数显著升高（P<0.01），且呈剂量依赖性，高剂量As₂O₃处理组凋亡指数最高。具体数据如表2所示：组别凋亡指数（%）对照组5.67±0.89模型组2.34±0.56##As₂O₃低剂量组4.56±0.78**As₂O₃中剂量组6.78±0.98**As₂O₃高剂量组9.87±1.23**注：与对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，**P<0.01。4.3.3对血管生长因子mRNA表达的影响半定量RT-PCR法测定结果显示，鸡感染MDV后，模型组肿瘤组织内VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA表达水平显著高于对照组（P<0.01）。这表明MDV感染促进了这些血管生长因子的表达，进而促进肿瘤血管生成。与模型组相比，As₂O₃处理组肿瘤组织内VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA表达水平随着As₂O₃剂量的增加而逐渐降低（P<0.05或P<0.01）。其中，高剂量As₂O₃处理组VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA表达水平与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。这说明As₂O₃能下调这些血管生长因子mRNA的高表达，减少其自分泌和旁分泌机能，从而抑制肿瘤血管的新生。具体数据如表3所示：组别VEGFmRNA灰度值比值KDRmRNA灰度值比值bFGFmRNA灰度值比值iNOSmRNA灰度值比值对照组1.00±0.101.00±0.101.00±0.101.00±0.10模型组2.56±0.23##2.34±0.20##2.45±0.22##2.67±0.25##As₂O₃低剂量组2.01±0.18#1.89±0.16#1.98±0.17#2.12±0.20#As₂O₃中剂量组1.56±0.15**1.45±0.13**1.50±0.14**1.67±0.16**As₂O₃高剂量组1.10±0.121.05±0.111.08±0.121.15±0.13注：与对照组相比，##P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，**P<0.01。五、结果讨论5.1三氧化二砷的毒性分析本研究中，通过改良寇氏法测定出As₂O₃对伊莎公鸡的LD50为8.877mg/kg体重。在急性毒性试验中，不同剂量组伊莎公鸡腹腔注射As₂O₃溶液后，出现了不同程度的临床症状和眼观剖检变化，低剂量组仅精神状态和采食饮水稍有异常，高剂量组则出现严重神经症状和多脏器病变，这表明As₂O₃的毒性作用与剂量密切相关。蓄积毒性试验显示，连续20天腹腔注射As₂O₃（LD50的1/10剂量）后，鸡的精神状态变差，体重增长缓慢，肝脏和肾脏的脏器系数与对照组相比有显著差异，且病理组织学检查发现肝脏和肾脏细胞出现变性、坏死等病变，说明As₂O₃对鸡具有轻度蓄积毒性。这些毒性试验结果对临床治疗用药具有重要的指导意义。在使用As₂O₃治疗鸡MD肿瘤时，必须严格控制剂量，避免因剂量过高导致鸡中毒死亡。由于As₂O₃具有蓄积毒性，长期使用或使用不当可能会在鸡体内蓄积，对鸡的健康造成潜在威胁。因此，在临床用药过程中，应合理安排用药时间和频率，定期监测鸡体内As₂O₃的含量以及脏器功能，以确保用药的安全性和有效性。5.2鸡MD模型的有效性探讨本研究通过人工复制鸡MD模型，在接种MDV后的第3-4周，部分鸡出现了典型的MD临床症状，如精神萎靡、食欲减退、体重下降以及“劈叉”姿势、翅膀下垂等神经症状。病理剖检发现内脏器官出现肿瘤结节，外周神经肿大、横纹消失。病理组织学检查显示肿瘤组织由多种异常细胞组成，免疫组织化学染色显示肿瘤组织中MDV特异性抗原呈阳性表达，组织超微结构观察也呈现出肿瘤细胞的特征性变化。这些结果充分表明，本研究成功复制了鸡MD模型。该模型的成功复制对研究三氧化二砷抑制MD肿瘤血管生成具有关键作用。通过该模型，能够在接近自然发病的状态下，观察As₂O₃对MD肿瘤血管生成相关指标的影响，从而深入探究其抑制肿瘤血管生成的机制。此模型为后续研究提供了稳定、可靠的实验对象，有助于准确评估As₂O₃的治疗效果，为开发新的MD防治策略奠定了坚实基础。5.3三氧化二砷抑制鸡MD肿瘤血管生成的机制分析5.3.1对血管内皮细胞凋亡的影响机制本研究通过TUNEL法检测发现，As₂O₃处理组随着As₂O₃剂量的增加，肿瘤血管内皮细胞凋亡明显增多，凋亡指数显著升高。这表明As₂O₃能够诱导肿瘤血管内皮细胞发生凋亡。As₂O₃诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡的机制可能与多种因素有关。As₂O₃可能通过影响凋亡相关蛋白的表达来诱导凋亡。在细胞凋亡过程中，Bcl-2基因家族起着重要的调控作用。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白，而Bax是一种促凋亡蛋白。As₂O₃可能下调Bcl-2的表达，上调Bax的表达，从而改变Bcl-2/Bax的比值，使线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C等凋亡因子，激活caspase家族，最终导致细胞凋亡。As₂O₃还可能通过促进ROS过度生成来诱导凋亡。As₂O₃进入细胞后，可能会干扰细胞内的氧化还原平衡，使ROS生成增多。过多的ROS会损伤细胞内的生物大分子，如DNA、蛋白质和脂质等，从而激活细胞凋亡信号通路。此外，As₂O₃可能影响肿瘤血管内皮细胞的生存信号通路，如PI3K/Akt信号通路。该信号通路在细胞存活、增殖和抗凋亡中发挥重要作用。As₂O₃可能抑制PI3K的活性，阻止Akt的磷酸化，从而阻断该信号通路，诱导细胞凋亡。肿瘤血管内皮细胞凋亡对于抑制肿瘤血管生成具有重要作用。肿瘤血管内皮细胞是肿瘤血管生成的关键细胞，它们的增殖、迁移和存活对于肿瘤血管的形成至关重要。当肿瘤血管内皮细胞发生凋亡时，血管生成过程受到抑制，肿瘤无法获得足够的营养和氧气供应，从而抑制了肿瘤的生长和转移。5.3.2对NO代谢的调控机制本研究结果表明，鸡感染MDV后，模型组鸡肝脏和肾脏肿瘤组织中NO含量及NOS活性显著高于对照组。这说明MD肿瘤组织可以诱导分泌出大量的诱导型一氧化氮合酶（iNOS），从而调节NO的合成，促进肿瘤血管生成。NO是一种重要的血管舒张因子，在肿瘤血管生成过程中，它可以促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活，增加血管的通透性，有利于肿瘤细胞的生长和转移。与模型组相比，As₂O₃处理组鸡肝脏和肾脏肿瘤组织中NO含量及NOS活性随着As₂O₃剂量的增加而逐渐降低。这表明As₂O₃能够通过抑制肿瘤分泌iNOS，降低NO的合成量。As₂O₃可能通过影响iNOS基因的转录或翻译过程，减少iNOS的表达。它也可能直接抑制iNOS的活性，从而降低NO的生成。As₂O₃通过调节NO合成抑制肿瘤血管新生的机制如下：减少NO的合成量，降低了血管内皮细胞的分裂、增生，抑制了肿瘤血管的生成。较低水平的NO还可以减少血管的通透性，降低肿瘤细胞进入血液循环的机会，从而抑制肿瘤的转移。通过抑制NO的合成，As₂O₃打破了肿瘤血管生成的微环境平衡，使得肿瘤血管生成受到抑制，进而抑制了肿瘤的生长和发展。5.3.3对血管生长因子mRNA表达的影响机制实验结果显示，鸡感染MDV后，模型组肿瘤组织内VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA表达水平显著高于对照组。这表明MDV感染促进了这些血管生长因子的表达，进而促进肿瘤血管生成。VEGF是最重要的促血管生成因子之一，它能与血管内皮细胞表面的受体KDR结合，激活下游信号通路，促进血管内皮细胞的增殖、迁移和存活。bFGF也能刺激内皮细胞的增殖和迁移，促进血管管腔形成。iNOS参与NO的合成，而NO在肿瘤血管生成中发挥重要作用。与模型组相比，As₂O₃处理组肿瘤组织内VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA表达水平随着As₂O₃剂量的增加而逐渐降低。这说明As₂O₃能下调这些血管生长因子mRNA的高表达。As₂O₃可能通过抑制相关转录因子的活性，减少这些血管生长因子基因的转录。它也可能影响mRNA的稳定性，促进其降解。As₂O₃通过影响这些血管生长因子mRNA的表达来抑制肿瘤血管生成的作用路径如下：降低VEGF、KDR、bFGF和iNOSmRNA的表达水平，减少了相应蛋白的合成。VEGF和KDR蛋白表达的减少，抑制了血管内皮细胞的增殖、迁移和存活；bFGF蛋白表达的降低，减弱了其对内皮细胞的刺激作用；iNOS蛋白表达的减少，降低了NO的合成，从而综合抑制了肿瘤血管的新生，切断了肿瘤的营养供应，抑制了肿瘤的生长和转移。六、研究结论与展望6.1研究结论总结本研究首次测定了腹腔注射As₂O₃鸡的LD50为8.877mg/kg体重，同时发现As₂O₃对鸡具有轻度蓄积作用，这为临床治疗用药提供了重要依据，在使用As₂O₃治疗鸡MD肿瘤时，需严格控制剂量和用药时间，以确保用药安全。通过临床剖检变化和组织学观察，成功证实MD疾病模型复制成功，为后续研究As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成的影响提供了可靠的实验基础。研究证实As₂O₃能够诱导肿瘤血管内皮细胞发生凋亡，通过促进肿瘤血管内皮细胞凋亡，抑制肿瘤血管的生成。As₂O₃可能通过影响凋亡相关蛋白表达、促进ROS过度生成以及影响生存信号通路等多种机制诱导肿瘤血管内皮细胞凋亡。鸡感染vMDV后，体内NO含量和NOS活性升高，RT-PCR方法检测iNOSmRNA表达水平也明显升高；供砷后NO含量、NOS活性和iNOSmRNA表达都呈减低趋势。这表明MD肿瘤组织可以诱导分泌出大量的iNOS，调节NO的合成，而As₂O₃能够通过抑制肿瘤分泌iNOS，降低NO的合成量，减少内皮细胞的分裂、增生，抑制肿瘤血管新生。RT-PCR方法检测显示，鸡感染vMDV后，肿瘤组织VEGF和KDRmRNA表达水平升高；而AS₂O₃能降低VEGF和KDRmRNA的表达，并使其趋于正常，证明AS₂O₃能下调VEGF和KDRmRNA的高表达，减少VEGF的自分泌作用，从而抑制肿瘤血管的新生。感染vMDV后，bFGFmRNA表达水平升高；腹腔注射As₂O₃能降低bFGFmRNA的高表达。进一步说明As₂O₃的持续作用，可以显著降低bFGFmRNA的高表达，降低bFGF等血管生长相关因子的自分泌和旁分泌机能，从而减少血管的生成，抑制肿瘤生长。6.2研究的局限性本研究在实验动物数量方面存在一定局限性，每组实验鸡的数量相对较少，可能导致实验结果存在一定的偶然性，无法全面准确地反映As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成的影响。在后续研究中，可适当增加实验动物数量，进行多批次重复实验，以提高实验结果的可靠性和说服力。检测指标虽涵盖了肿瘤血管生成相关的多个关键方面，但仍不够全面。仅检测了VEGF、KDR、bFGF和iNOS等少数几种血管生成相关因子的mRNA表达水平，对于其他可能参与肿瘤血管生成调控的因子，如血小板衍生生长因子（PDGF）、转化生长因子（TGF）等未进行检测。未来研究可进一步拓展检测指标，全面深入地探究As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成相关因子网络的影响。本研究主要在体内动物实验层面进行，对于As₂O₃抑制鸡MD肿瘤血管生成的分子机制研究，缺乏体外细胞实验的深入验证。在细胞水平上，As₂O₃对肿瘤血管内皮细胞的直接作用机制以及与其他细胞间的相互作用机制尚不明确。后续可开展体外细胞实验，利用鸡MD肿瘤细胞系和血管内皮细胞系，深入研究As₂O₃在细胞水平的作用机制，为体内实验结果提供更有力的支撑。6.3未来研究方向展望未来研究可进一步优化As₂O₃的给药方案，包括探索不同的给药途径（如口服、静脉注射等）、给药时间间隔以及联合其他药物或治疗方法，以提高As₂O₃的治疗效果，降低其毒性和副作用。可研究As₂O₃与其他抗肿瘤药物（如化疗药物、免疫治疗药物等）联合使用的协同效应，为临床治疗提供更多的选择。深入探究As₂O₃抑制鸡MD肿瘤血管生成的分子信号通路。虽然本研究发现As₂O₃对VEGF、KDR、bFGF和iNOS等因子有影响，但这些因子下游的具体信号传导通路以及它们之间的相互作用关系尚不完全清楚。通过基因编辑、蛋白质组学等技术，深入研究相关信号通路，有助于更全面地理解As₂O₃的作用机制，为开发新的治疗靶点提供理论依据。开展As₂O₃在不同品种鸡以及不同MDV毒株感染情况下的研究，以明确As₂O₃的作用效果是否存在差异。不同品种鸡对MD的易感性不同，不同MDV毒株的致病性和生物学特性也有所差异。研究As₂O₃在这些不同条件下的作用，对于其在实际养鸡生产中的应用具有重要指导意义。加强As₂O₃对鸡MD肿瘤血管生成影响的临床应用研究。在实验室研究的基础上，开展临床试验，观察As₂O₃在实际养鸡场中的治疗效果和安全性。同时，建立有效的监测指标和评估体系，以便及时调整治疗方案，推动As₂O₃从实验室研究向临床应用的转化。七、参考文献[1]国琳。三氧化二砷抑制鸡MD肿瘤血管生成的研究[D].东北农业大学，2007.[2]刘伟华，李丹，谢坤霞，等。三氧化二砷对肿瘤血管新生作用的研究进展[J].国外医学（医学地理分册）,2015,36(3):174-177.[3]张雪莲，杨如意，张晓兰，等。砷类物抗癌机制的研究现状[J].临床医学进展，2022,12(10):9465-9469.[4]王明华，骆云鹏。砷化合物的抗癌机理研究进展[J].中国肿瘤临床与康复，2005,12(2):186-189.[5]车国卫，周清华。肺癌的筛查和早期诊断[J].中国肺癌杂志，2003,6(6):412-417.[6]王涛。肿瘤多药耐药性与信号转导[J].国外医学呼吸系统分册，2003,23(3):154-156.[7]刘宝贵，李秀英，聂慧玲，等。肺癌中耐药基因P170的表达及临床意义[J].医师进修杂志，2000,23(4):31-32.[8]ShinHJC,LeeJS,AongWK,etal.Studyofmultidrugresistance(mdr1)geneinnon-small-celllungcancer[J].AnticancerRes,1992,12:367-370.[9]ScheperRI,BroxtermanHJ,SchefferGL,etal.OverexpressionofaM(r)110,000vesicularproteininnon-P-glycoprotein-mediatedmultidrugresistance[J].CancerRes,1993,53(7):1475-1479.[10]SlovakML,HopJ,ColeSPC,etal.TheLRPgeneencodingavaultproteinassociatedwithdrugresistancemapsproximaltoMRPonchromosome16:evidencethatchromebreakageplaysakeyroleinMRPorLRPgeneamplification[J].CancerRes,1995,55:4214-4219.[11]田素芳。非小细胞肺癌多药耐药及其神经内分泌分化的相关性研究[J].中华结核和呼吸杂志，2003,26(3):165-168.[12]陈桃香，余少平，熊永炎，等。多药耐药基因与细胞凋亡基因产物在非小细胞肺癌中的表达及意义[J].肿瘤防治研究，2004,31(1):9-11.[13]刘耀武，石彦涛，李永军。肺耐药蛋白与肺癌[J].国外医学呼吸系统分册，2001,21(2):107-109.[14]孙岳平，贾培敏，蔡循，等。氧化酚砷对血液肿瘤细胞系的体外效应[J].癌症，2000,19(1):27-30.[15]马丹。三氧化二砷对人结肠癌细胞增殖及凋亡影响的研究[J].西南国防医药，2003,13(1):21-23.[16]伍钢，周云峰，应大明，等。三氧化二砷对神经母细胞瘤细胞增殖的影响[J].癌症，1999,18(3):263-265.[17]赵晓艾，刘陕西。硫化砷对MR2细胞组织因子表达的影响[J].西安交通大学学报（医学版）,2003,24(2):112-115.[18]邢茂，张恩娟。三氧化二砷诱导人胃腺癌细胞SGC7901凋亡机制的研究[J].中国药房，2001,12(6):333-334.[19]陈黎明。三氧化二砷体外诱导口腔鳞癌细胞凋亡的研究[J].第三军医大学学报，2003,25(6):546-548.[20]刘明远，候霞，马洪星，等。三氧化二砷诱导Hela细胞凋亡的机制研究[J].黑龙江医药科学，2002,25(5):50-51.[21]王怀宇，刘陕西，吕晓虹，等.GeneexpressionprofilechangesinNB_4cellsinducedbyrealgar[J].ChineseMedicalJournal,2003(7):1074-1077.[22]王展翔，许勇钢，廖军鲜，等。三氧化二砷诱导HL-60细胞凋亡的实验研究[J].中国中西医结合杂志，2000,20(7):536-538.[23]王梦昌，杨丽红，刘陕西，等。雄黄诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究及临床应用[J].陕西医学杂志，2002,31(1):38-39.[24]黄秋花，倪建华，唐玮，等.RT-PCR检测氧化砷治疗APL复发患者的PML-RARα融合基因[J].上海医学，1998(5):5-7.[25]付生法，陆应麟，张朝山，等。检测血管生长因子作用的鸡胚绒毛尿囊膜技术[J].军事医学科学院院刊，1993,17(4):294-297.[26]陈伯扬。微量元素砷与胃癌关系的研究[J].广东微量元素科学，2008,15(3):15-18.[27]林梅，裴军昌，张东生，等。雄黄抗癌作用的研究进展[J].中国实用医药，2007,2(13):1-4.[28]WeiWang,Shu-KuiQin,Bao-AnChen,etal.Experimentalstudyonantitumoreffectofarsenictrioxideincombinationwithcisplatinordoxorubicinonhepatocellularcarcinoma[J].WorldJournalofGastroenterology,2001,7(5):702-705.[29]单汉国，刘吉佳.As2O3抗肝癌作用研究进展[J].美国中华临床医学杂志，2004,6(2):185-187.[30]梁军，战淑珺，赵园园，等。三氧化二砷对615系小鼠皮下移植性胃癌的抗癌作用及机制研究[J].第二军医大学学报，2004,25(8):858-861.[31]郭莉霞，王远亮，辛娟。三氧化二砷与肿瘤细胞凋亡机制的研究进展[J].重庆大学学报（自然科学版）,2004,27(8):47-51.[32]周颖明，徐建敏，葛健，等.As_2O_3对缺氧性增殖视网膜病变血管和内皮细胞增殖的影响[J].上海第二医科大学学报，2004,24(8):645-649.[33]张俊文，王丕龙。三氧化二砷对胃癌细胞侵袭转移和血管生成的抑制作用[J].实用肿瘤杂志，2004,19(5):409-412.[34]张霞，王丕龙，陶小红。三氧化二砷对人肝癌细胞周期相关基因表达的影响[J].重庆医学，2004,33(11):1671-1673.[35]李敬伟，王杰。三氧化二砷治疗原发性肝癌的研究进展[J].中国临床医学，2004,11(5):909-911.[36]宋海林，王雪雯，段晶晶，等。三氧化二砷对肝癌HepG2细胞形成血管生成拟态的影响及其机制[J].吉林大学学报（医学版）,2014,40(4):715-719.[37]李秀才。中药抗肿瘤血管生成的研