CN118388630B 生物合成人体结构性材料vi型胶原蛋白的方法 （山西锦波生物医药股份有限公司）

202310883890.42023.07.18生物合成人体结构性材料VI型胶原蛋白的提供了生物合成人体结构性材料VI型胶原24.根据权利要求3所述的核酸，所述核酸包含针对大肠杆菌表达进行密码子优化的核的核酸、根据权利要求6-11所述的载体和根据权利要求12-15任一项所述的宿主细胞中的利要求6-11任一项所述的载体和/或根据权利要求12-15任一项所述的宿主细胞在制备生21.在体外促进细胞粘附的方法，其包括使根据12-15任一项所述的宿主细胞与细胞在体外接触的328.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(1)包括29.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(2)包31.根据权利要求29所述的方法，其中平衡工作液包含100-500mM氯化钠、10-50mM33.根据权利要求32所述的方法，其中粗36.根据权利要求35所述的方法，其中以蛋白总量与TEV酶总量比为10-100:1酶切2-37.根据权利要求32所述的方法，其中精纯包括用强阴离子交换层析柱对含目标蛋白38.根据权利要求37所述的方法，其中梯度洗脱包括0体积、15-30％B液1-5分钟然后保持3个柱体积、30-50％B液1-5分钟然后保持3个柱体积、39.根据权利要求32所述的方法，其中反挂镍40.根据权利要求39所述的方法，其中Ni-琼脂糖凝胶柱纯化用洗脱液包含10-50mM利要求6-11任一项所述的载体和/或根据权利要求12-15任一项所述的宿主细胞在制备用4与基底层中的Ⅳ型胶原和其它珍珠白蛋白结合，Ⅵ型胶原可以在肌肉细胞和ECM之间建立5[0010]GERGGPGERGPRGTPGTRGPRGDPGEAGPQGDQGREGPVGVPGDPGEAGPIGPKGYRGDEGPPGSEGARGAPGPAGPPGDPGLMGERGEDGPA[0014]GPPGLRGDPGFEGERGKPGLPGEKGEAGDPGRPGDLGPVGYQGMKGEKGSRGEKGSRGPKGYKGEKGKRGIDGVDGVKGEMGYPGLPGCKGSPGFDGIQGPPGPKGDPGAFGLKGEKGEPGADGEAGRPGSSGPSGDEGQPGEPGPPGEKGEAGDEGNPGPDGA[0015]GIQGPPGPKGDPGAFGLKGEKGEPGADGEAGRPGSSGPSGDEGQPGEPGPPGEKGEAGDEGNPGPDGAPGERGGPGERGPRGTPGTRGPRGDPGEAGPQGDQGREGPVGVPGDPGEAGPIGPKGYRGDEGPP(SEQIDNO:[0019]GDPGEAGPIGPKGYR[0020]GPPGLRGDPGFEGE[0021]GPKGYKGEKGKRGID[0022]GEKGEPGADGEAGRPGS[0023]GERGPRGTPGTRGPRGD[0024]GSEGARGAPGPAGPPGDPGLMGERGEDGPAGNGTEGFPGFPGYPGNRGAPGINGTKGYPGLKGDEGEAGDPGDDNNDIAPRGVKGAKGYRGPEGPQGPPGHQGPPG所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残6[0045]在一个实施方案中，步骤(1)包括将大肠杆菌细胞在LB培养基中培养并且通过7[0048]在一个实施方案中，粗纯包括对上清液进行Ni-琼脂糖凝胶柱纯化以得到含目标15-30％B液1-5分钟然后保持3个柱体积、30-50％B液1-5分钟然后保持3个柱体积、50-8置的氨基酸之后添加氨基酸。添加指在氨基酸序列的C端和/或N端添加一个或多个氨基酸9苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性。中突变一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列或者(2)与SEQID所述氨基酸序列中突变一个或多个氨基酸残基前对其进行操纵可能是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰核酸的技术是本领域[0109]用于指导本发明的载体或核酸构建体在细菌宿主细胞中的转录的合适启动子的酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽淀粉酶基因[0112]细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因中获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,JournalofBacteriology[细菌学杂用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。[0119]酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:598[0120]控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5'-端本身可以含有在翻译阅读框中天然[0121]细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下的基为A区的相互作用。II型胶原和聚集蛋白聚糖通过富含亮氨酸重复序列的蛋白聚糖类复合多个便利的限制位点以使编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将核酸或包含该核酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷[0127]重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座[0130]细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素[0131]选择性标记可以是如WO2010/039889中描述的双选择性[0132]载体可以含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外[0136]用于在酵母宿主细胞中使用的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合以及ARS4与CEN列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸[0138]用于连接上述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)等。真菌宿主细胞可产担子酵母(basidiosporogenousyeast)和属于半知菌纲(FungiImperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母菌属乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、卡尔酵母(Saccharomycescarls酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、卵形酵母(Saccharomycesoviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia入pET-28a-Trx-His表达载体中得到重组表达质粒。可以将构建成功的表达质粒转化大肠加入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中；(2)将混合物置于冰上冰浴(例如10-60min，例如5min，例如2min)；(3)加入液体LB培养基，然后培养(例如于35-40℃,例如37℃、150-[0155]步骤(2)可以包括将单菌落于含有抗生素储液的LB培养基中培养(例如在150-[0156]步骤(3)可以包括将菌体用平衡工作液重悬，将菌液降温至≤15℃,进行均质(例[0157]步骤(3)可以包括对多肽进行纯化和酶切。纯化可以是粗纯，包括对上清液进行[0158]步骤(3)可以包括将上清液加入柱材中，用洗杂液清洗杂蛋白。洗杂液可以包含切后的产物(例如透析后的产物)对Ni-琼脂糖凝胶柱纯化。洗脱液可以包含10-50mM(例如[0172]GIQGPPGPKG[0175]DPGLMGERGEDGPAGNGTEGFPGFPGYPGNRGAPGINGTKGYPGLKGDEGEAGDPGDDNNDIAPRGVKGAKGYRGPEGPQGPPGHQGPPGP[0179]FDGIQGPPGPKGDPGAFGLKGEKGEPGADGEAGRPGSSGPSGDEGQPGEPGPPGEKGEAGDEGNPGPD[0182]FDGIQGPPGPKGDPGAFGLKGEKGEPGADGEAGRPGSSGPSGDEGQPGEPGPPGEKGEAGDEGNPGPD[0185]EAGPIGPKGYR[0189]EAGPIGPKGYRGDEGPPGSEGARGAPGPAGPPGDPGLMGERGEDGPA(C6c的重复单元的氨基酸[0192]PGPPGEKGEAGDEGNPGPDGAPGERGGPGERGPRGTPGTRGPRGDPGEAGPQGDQGREGPVGVPGDP[0194]PGPPGEKGEAGDEGNPGPDGAPGERGGPGERGPRGTPGTRGPRGDPGEAGPQGDQGREGPVGVPGDPGEAGPIGPKGYRGDEGPP(C6d的重复单元的氨基酸序列为SEQIDNO:11，重复单元数目为2，[0201]GPPGLRGDPGFEGERGKPGLPGEKGEAGDPGRPGDL(C6e的重复单元的氨基酸序列为SEQ[0208]GMKGEKGSRGEKGSRGPKGYKGEKGKRGIDGVDGVKGEM(C6f的重复单元的氨基酸序列为[0215]GCKGSPGFDGIQGPPGPKGDPGAFGLKGEKGEPGADGEAGRP(C6g的重复单元的氨基酸序列[0222]GSSGPSGDEGQPGEPGPPGEKGEAGDEGNPGPDGAP(C6h的重复单元的氨基酸序列为SEQ[0229]GERGGPGERGPRGTPGTRGPRGDPGEAGPQGDQGRE(C6i的重复单元的氨基酸序列为SEQ[0231]GDPGEAGPIGPKGYRG[0236]GDPGEAGPIGPKGYRGDEGPPGSEGARGAPGPAGPPGDPGLMGERGEDGPA(C6j的重复单元的[0243]GTEGFPGFPGYPGNRGAPGINGTKGYPGLKGDEGEAGDPGDD(C6k的重复单元的氨基酸序列[0246]GGACCCCCAGGGTTGCGTGGTGATCCGGGCTTCGAAGGTGAACGCGGCAAACCGGGTCTGCCTGGCGAGAAGGGCGAGGCGGGTGACCCGGGCCGCCCTGGTGACCTGGGTCCGGTGGGTTATCAGGGTATGAAAGGCGAGAAGGGCTCGCGTGGCGAGAAGGGTAGCCGTGGTCCGAAAGGGTATAAAGGCGAGAAGGGCAAGCGCGGCATTGATGGCGTTGATGGTGTTAAAGGTGAAATGGGTTACCCGGGCCTGCCAGGGTGCAAAGGCTCTCCGGGTTTTGATGGTATCCAGGGTCCGCCGGGTCCGAAAGGCGACCCGGGCGCGTTTGGTTTGAAGGGCGAGAAGGGTGAGCCGGGGGCGGATGGTGAAGCCGGCCGTCCGGGTAGCAGCGGTCCGAGCGGTGATGAAGGTCAGCCGGGTGAACCGGGTCCGCCGGGAGAAAAGGGCGAGGCAGGCGACGAAGGAAACCCGGGTCCGGACGGCGCTCCGGGTGAGCGTGGCGGTCCGGGTGAGCGCGGTCCGCGTGGCACCCCGGGAACCCGTGGCCCGCGTGGCGACCCAGGCGAGGCGGGTCCGCAAGGTGACCAAGGTAGAGAAGGTCCGGTTGGCGTGCCGGGCGACCCGGGTGAGGCGGGTCCCATCGGTCCGAAGGGTTACCGTGGTGACGAGGGTCCTCCGGGCAGCGAAGGTGCGCGTGGAGCCCCTGGACCGGCAGGCCCACCGGGCGACCCAGGTCTGATGGGTGAGCGCGGTGAAGATGGTCCGGCGGGTAACGGTACGGAAGGCTTCCCGGGGTTCCCGGGATACCCGGGCAACCGTGGTGCGCCAGGTATCAATGGCACCAAAGGCTATCCGGGCCTTAAGGGCGACGAAGGCGAGGCTGGTGACCCGGGCGATGATAATAACGATATTGCACCGCGTGGCGTCAAAGGTGCTAAAGGTTACCGCGGTCCAGAAGGTCCGCAAGGTCCACCGGGTCACCAGGGTCCGCCGGGTCCGGAT([0248]GGACCACCCGGGCTCCGTGGTGACCCGGGCTTCGAAGGCGAGCGCGGCAAACCGGGTTTGCCGGGTGAAAAGGGTGAAGCAGGCGACCCGGGTCGCCCAGGCGACCTGGGTCCGGTTGGTTACCAAGGTATGAAAGGGGAGAAGGGATCTAGAGGCGAAAAAGGCTCCCGCGGTCCGAAAGGCTATAAGGGCGAAAAGGGCAAGCGTGGCATTGATGGTGTCGATGGTGTTAAAGGCGAAATGGGTTATCCGGGTCTGCCGGGCTGCAAAGGTAGCCCGGGTTTTGATGGTATCCAGGGTCCGCCTGGTCCGAAGGGCGACCCGGGTGCGTTTGGTCTGAAAGGTGAGAAGGGCGAGCCGGGCGCGGATGGTGAGGCGGGTCGTCCGGGCAGCAGCGGTCCGAGCGGTGACGAAGGTCAGCCGGGCGAGCCGGGTCCGCCTGGTGAAAAGGGTGAGGCCGGTGACGAGGGCAACCCGGGTCCGGATGGCGCGCCGGGCCCACCGGGCTTACGTGGTGACCCGGGCTTCGAAGGTGAACGTGGTAAGCCGGGTTTGCCGGGTGAGAAGGGCGAAGCTGGCGACCCGGGCCGTCCGGGCGACCTGGGTCCGGTGGGTTATCAGGGTATGAAAGGCGAGAAGGGTTCTCGTGGCGAAAAGGGTTCCCGTGGTCCGAAAGGCTACAAAGGTGAAAAGGGAAAGCGCGGCATTGATGGTGTGGATGGCGTGAAAGGTGAGATGGGTTACCCGGGTCTGCCTGGTTGTAAAGGTTCCCCGGGATTCGACGGCATCCAGGGTCCGCCCGGTCCGAAAGGTGACCCGGGCGCGTTTGGCCTGAAAGGCGAAAAGGGCGAGCCGGGTGCCGATGGCGAGGCAGGACGTCCGGGGTCGAGCGGCCCAAGCGGTGATGAAGGCCAACCGGGTGAGCCGGGCCCACCGGGCGAGAAGGGTGAGGCTGGCGACGAAGGTAATCCGGGTCCGGA[0250]GGAGAAAGGGGGGGCCCGGGCGAGCGCGGCCCGCGTGGCACCCCGGGGACCCGTGGCCCGCGTGGTGACCCGGGCGAGGCTGGCCCGCAAGGTGATCAAGGTCGTGAAGGTCCGGTGGGCGTGCCGGGTGATCCGGGTGAGGCGGGCCCCATCGGTCCGAAAGGTTACCGTGGCGATGAGGGCCCTCCGGGTAGCGAAGGCGCGCGTGGCGCTCCGGGTCCGGCGGGTCCGCCAGGCGACCCGGGCCTGATGGGTGAACGCGGCGAAGATGGTCCGGCGGGCGAACGCGGTGGTCCGGGCGAGCGCGGTCCGCGTGGCACGCCGGGCACTCGCGGCCCACGTGGTGATCCGGGTGAGGCGGGTCCGCAGGGTGACCAGGGTCGTGAAGGTCCAGTTGGTGTTCCGGGCGACCCGGGTGAAGCCGGTCCGATTGGTCCGAAGGGTTACCGCGGCGACGAAGGCCCACCGGGTAGCGAAGGTGCCCGTGGCGCACCGGGTCCGGCAGGCCCACCGGGCGACCCGGGCTTGATGGGCGAGCGCGGCGAGGACGGCCCGGCTGGCGAGCGCGGTGGTCCGGGTGAGCGCGGCCCGCGTGGCACCCCGGGCACCCGTGGTCCGCGTGGTGACCCGGGTGAGGCAGGTCCTCAAGGTGATCAGGGCAGAGAAGGTCCGGTCGGTGTTCCGGGCGACCCGGGAGAGGCGGGTCCGATCGGCCCGAAGGGTTATCGTGGTGACGAAGGTCCGCCTGGTAGCGAAGGCGCGCGTGGCGCGCCAGGCCCTGCCGGTCCACCGGGTGACCCGGGCCTGATGGGTGAGCGTGGTGAGGAT[0252]GGAATACAAGGG[0253]GCGAGAAAGGC[0254]GTCCGTCTGGC[0255]GTGAGGCCGGCG[0256]CGGCCCGGGCGAAC[0257]GATCCGGGCGAA[0258]TGCCGGGCGACCCGG[0259]CGAAGGTCCACCG[0260]TTTGGTTTGAAAGG[0261]CTGGCAGCTCGGGC[0262]AGGTGAGAAGGGC[0263]GGGGGAGCGCGGTG[0264]GGTCCGCGTGGT[0265]GTCCGGTGGGTGTTCCGGGCGACCCGGGCGAAGCTGGCCCGATCGGTCCGAAAGGTTATCGTGGTGAT[0267]GGGCCCCCAGGA[0268]GTCTGCCGGGTG[0269]TCCGCCTGGCCTGCG[0270]TGCCGGGTGAAAAA[0271]ACCGGGCTTGCG[0272]CCCGGTGAAAAGGG[0273]CAGGCCTGCGTGGT[0274]GGGTGAGAAAGGTG[0275]GGATTACGTGGT[0276]GCGAGAAGGGC[0277]GTTTGAGAGGTG[0280]GGGATGAAAGGAGA[0281]GGTTATAAAGGT[0282]GCGAGATGGGT[0283]GCCCAAAGGGT[0284]GCGTGAAAGGC[0285]GCAGCCGCGGT[0286]GCGTTGATGGC[0287]GTGAAAAGGGT[0288]GTATTGATGGT[0289]GTAGCCGTGGTG[0290]CAAACGTGGCATCG[0291]GAGAAGGGTTCCC[0292]GAAAAGGGCAAGC[0295]GGGTGTAAAGGA[0296]GAGATCCGGGTG[0297]CGAAGCAGGCCGTC[0298]CCTCCGGGTCCGA[0299]AACCGGGTGCTGAT[0300]TGATGGTATTCA[0301]AAGGGTGAAAAGG[0302]AAAGGTAGCCCGGG[0303]CGGGTGCGTTT[0304]CTGGTCGTCCGGGG[0305]GGGTCCGAAGGGT[0306]GGGTGCTGATGGTG[0307]GGCATCCAGGGC[0310]GGGTCAAGTGGA[0311]GTGAAAAAGGT[0312]GCTCCAGCGGTC[0313]CGAGAAGGGCG[0314]TAGCAGCGGTCCGT[0315]GAAAAGGGTGAGG[0316]AGCAGCGGCCCAT[0317]GAGAAGGGTGAAG[0318]AGCAGCGGTCCG[0319]AGAAAGGTGAGGCC[0320]GAGCGGTCCGTCCGG[0321]AAAGGCGAGGCAGGCGACGAAGGCAA[0324]GGAGAAAGGGGGG[0325]GGTCCGCGCGGC[0326]GCGAGCGTGGCG[0327]TCCGCGTGGTGATC[0328]GAGCGCGGAGGCCC[0329]CGCGTGGTGAC[0330]AACGTGGTGGCCCG[0331]GCGCGGCGACCCGG[0332]ACGCGGCGGTCC[0333]AGAGGCGACCCTGGT[0334]GAGGTGGTCCGGGCGAGCGCGGTCCGAGAGGCACCCCGGGCACCCGTGGTCCGCGTGGTGACCCGGGTGAAGCGGGTCCGCAAGGCGACCAGGGTCGTGA[0336]GGAGATCCCGGA[0337]GCCCGCCAGGCT[0338]CGACCCGGGCCTGA[0339]GAAGCCGGTCCGAT[0340]CTGAAGGTGCGCGT[0341]GATGGGTGAGCG[0342]ATCGGCCCGAAGGG[0343]GTGGTGCGCCTG[0344]CGGCGAAGATGGTCC[0345]GGTTACCGCGGT[0346]GCCCGGCTGGCCCACCGGGCGACCCGGGCTTGATGGGTGAACGTGGTGAGGACGGCCCGGCG(SEQID[0348]AGGGACAGAAGGATT[0349]GGCATTAACGGC[0350]GTGATCCGGGAG[0351]TAATCGTGGTGCAC[0352]GATGAGGGCGAGGC[0353]TCCCGGGTTATCCGG[0354]CCGGGCCTGAAAG[0355]GAAGGTTTTCCGGGC[0356]ATGGCACCAAGGGT[0357]GGGTGACGACGGT[0358]GTGCACCAGGGA[0359]CGAGGCCGGTGACCC[0360]ACCCGGGAAACCGTGGTGCTCCGGGCATTAACGGTACGAAAGGCTATCCTGGCCTGAAGGGCGACGAGGGTGAAGCTGGTGACCCGGGTGATGAT(SEQI了胶原工具酶酶切位点，胶原工具酶酶切位点的氨基酸序列为ENLYFQ，核苷酸序列为220rpm，37℃恒温摇床中7h。再将培养后的摇瓶降温至16℃,添加IPTG诱导表达一段时间[0367](3