CN118406625B 一种生产13-丙二胺的重组盐单胞菌及其构建方法和应用 （华南理工大学）

1,3-diaminopropane,athreecarb一种生产1，3-丙二胺的重组盐单胞菌及其本发明提供了一种生产1，3_丙二胺的重组菌表达不动杆菌来源的2_酮戊二酸4_氨基转移来自不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)来源的1,3_DAP异源合成途径，提高了1,3_DAP的产2所述dat_ddc核苷酸序列如SEQIDNO.61所示，所述asd_lysC核苷酸序列如SEQID棒状杆菌AT1302来源的ppc基因和py3.根据权利要求1所述的重组盐单胞菌，其特征在5.根据权利要求1～4任一项所述的重组盐单胞菌，其特征在于，所述盐单胞菌包括Halomonassp.。7.一种权利要求1～5任一项所述的重组盐单酸序列；所述ppc_pyc核苷酸序列如SEQIDNo.63DAP的生产周期较长(80～100h)进而导致生产强度不高，底盘菌株均需严格的无菌生产环和谷氨酸棒状杆菌CorynebacteriumglutamicumAT1302来[0007]进一步的，所述重组盐单胞菌还表达谷氨酸棒状杆菌Corynebacterium4[0015](2)编码2_酮戊二酸4_氨基转移酶和L_2，4_二氨基丁酸脱羧酶的核苷酸序列和[0016](3)编码2_酮戊二酸4_氨基转移酶和L_2，4_二氨基丁酸脱羧酶的核苷酸序列、[0017](4)编码2_酮戊二酸4_氨基转移酶和L_2，4_二氨基丁酸脱羧酶的核苷酸序列、[0018]所述编码2_酮戊二酸4_氨基转移酶和L_2，4_二氨基丁酸脱羧酶的核苷酸序列如5下，dat、ddc片段和pSEVA321Mmp1骨架重组形成新的质粒，命名为pSEVA321Mmp1-dat-ddc，以6[0068]步骤1：将提前制备好的S17_1大肠杆菌感受态细胞从_80℃拿出，在冰上解冻，[0071]步骤4：向离心管中加入400μLLB培养基(不含抗生素)，混匀后放入37℃摇床中7[0076](5)选择序列正确的单菌落进行扩培，12～16h后与Halomonassp.TD01在20LB平[0078]目的产物的大小通过PCR进行验证，结果表明Halomonassp.TD01菌株成功导入[0085]挑取单菌落接种于装有5mL种子培养基(60LB+Cm)的摇菌管中，置于摇床37℃,2O8用分光光度计在波长为600nm时的读数[0109]以质粒pSEVA321Mmp1_dat_ddc为模板扩增，获得片段dat_ddc序列。以质粒pSEVA321porin68_GFP为模板扩增，获得骨架pSEVA321porin68，参照实施例1的方法构建成质粒[0116]参照实施例1质粒构建方法，以质粒pSEVA321porin68_dat_ddc为模板扩增porin68_[0127](1)将上述构建的整合质粒进行扩培，12～16h后与Halomonassp.TD01在20LB平9[0132]以盐单胞菌Halomonassp.TD01为模板扩增，得到asd片段；以谷氨酸棒状杆菌CorynebacteriumglutamicumAT1302为模板进行扩增，得到lysC目的基因片段；以质粒[0141]利用pSEVA321porin58_asd_lysC质粒为模板，PCR扩增得到porin58_asd_lysC基因片段；利用pRE112_Backbone为模板PCR扩增pRE112骨架；同源臂G7L和G7R以Halomonas[0155]以谷氨酸棒状杆菌CorynebacteriumglutamicumAT1302为模板，PCR扩增得到[0164]利用pSEVA321porin140_aspC_rocG质粒为模板，PCR扩增得到porin140_aspC_rocG基因片段；利用pRE112_Backbone为模板PCR扩增pRE112骨架；同源臂G43L和G43R以Halomonas[0178]以谷氨酸棒状杆菌AT1302为模板，PCR扩增得到ppc、pyc基因片段；以质粒[0187]利用pSEVA321porin226_ppc_pyc质粒为模板，PCR扩增得到porin226_ppc_pyc基因片段；利用pRE112_Backbone为模板PCR扩增pRE112骨架；同源臂G49L和G49R以Halomonas[0198]具体步骤参照实施例2，将ppc_pyc基因序列插入到TD01_W3菌株的基因组中，经[0200]使用实施例3～5构建的五种改造菌进行发酵培养，发酵培养基中不添加诱导剂，