水产品中地西泮、甲硝唑、地美硝唑和氯丙嗪残留量的测定 超高效液相色谱-串联质谱法

水产品中地西泮、甲硝唑、地美硝唑和氯丙嗪残留量的测定超高效液相色谱-串联质谱法1范围本方法规定了水产品（包括鱼类、甲壳类、贝类、藻类等）中地西泮（Diazepam）、甲硝唑（Metronidazole）、地美硝唑（Dimetridazole）和氯丙嗪（Chlorpromazine）残留量的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于水产品肌肉、内脏、甲壳、贝肉等可食用部分中上述四种化合物残留量的定性鉴别和定量测定。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本方法的引用而成为本方法的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本方法；凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本方法。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27404实验室质量控制规范食品理化检测GB/T27607水产品抽样规范SN/T0212进出口动物性食品中甲硝唑、地美硝唑残留量的检测方法SN/T2205水产品中地西泮残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法SN/T2624进出口动物源性食品中氯丙嗪残留量的检测方法液相色谱-串联质谱法3术语和定义残留量：水产品可食用部分中，目标化合物（地西泮、甲硝唑、地美硝唑、氯丙嗪）及其代谢产物的总量，以质量分数（μg/kg）表示。定量限：在本方法规定的实验条件下，能够定量测定的目标化合物的最低浓度，满足定量要求（回收率在70%~120%，相对标准偏差≤20%）。定性限：在本方法规定的实验条件下，能够定性识别目标化合物的最低浓度，满足定性要求（特征离子对检出，相对丰度偏差符合规定）。基质效应：样品基质中其他组分对目标化合物的色谱分离和质谱响应产生的抑制或增强效应。4原理样品经均质后，加入适当的提取剂，通过涡旋、振荡或超声提取，使样品中的地西泮、甲硝唑、地美硝唑和氯丙嗪充分溶出；经离心、净化处理后，去除样品基质中的蛋白质、脂肪等干扰组分；采用超高效液相色谱进行分离，串联质谱仪进行检测，以多反应监测模式（MRM）定性，外标法或内标法定量。5试剂与材料除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，实验用水符合GB/T6682规定的一级水。5.1试剂甲醇（CH₃OH）：色谱纯。乙腈（CH₃CN）：色谱纯。甲酸（HCOOH）：色谱纯，纯度≥98%。乙酸铵（CH₃COONH₄）：分析纯，纯度≥99%。氢氧化钠（NaOH）：分析纯，纯度≥96%。盐酸（HCl）：分析纯，纯度36%~38%。无水硫酸镁（MgSO₄）：分析纯，纯度≥99.5%，600℃灼烧4h，冷却后密封保存。氯化钠（NaCl）：分析纯，纯度≥99.5%，600℃灼烧4h，冷却后密封保存。乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）：分析纯，纯度≥99%。5.2标准品地西泮标准品：CAS号439-14-5，纯度≥99.0%，保存于-20℃避光环境。甲硝唑标准品：CAS号443-48-1，纯度≥99.0%，保存于-20℃避光环境。地美硝唑标准品：CAS号551-92-8，纯度≥99.0%，保存于-20℃避光环境。氯丙嗪标准品：CAS号50-53-3，纯度≥99.0%，保存于-20℃避光环境。内标物（可选）：地西泮-D5、甲硝唑-D4、地美硝唑-D3、氯丙嗪-D6，纯度≥98.0%，用于消除基质效应，保存于-20℃避光环境。5.3标准溶液的配制5.3.1标准储备液（1000μg/mL）分别准确称取地西泮、甲硝唑、地美硝唑、氯丙嗪标准品各10.0mg（精确至0.01mg），置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，涡旋振荡5min，使其充分溶解，得到浓度为1000μg/mL的单标储备液。密封后置于-20℃避光保存，有效期6个月。5.3.2混合标准中间液（10μg/mL）分别准确吸取上述四种单标储备液各100μL，置于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，涡旋振荡5min，得到浓度为10μg/mL的混合标准中间液。密封后置于-20℃避光保存，有效期1个月。5.3.3混合标准工作液根据检测需求，用甲醇逐级稀释混合标准中间液，配制浓度为0.1μg/L、0.5μg/L、1.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L的混合标准工作液，现配现用。若采用内标法，需在混合标准工作液中加入适量内标储备液，使内标物浓度与目标化合物浓度匹配（通常为10μg/L）。5.3.4内标储备液与内标工作液（可选）准确称取相应内标物各10.0mg（精确至0.01mg），置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为1000μg/mL的内标储备液，-20℃避光保存，有效期6个月。吸取适量内标储备液，用甲醇稀释至10μg/mL的内标工作液，现配现用。5.4实验材料固相萃取柱：C18柱（500mg/6mL）、HLB柱（60mg/3mL），或等效固相萃取柱，使用前用5mL甲醇和5mL水活化。滤膜：有机相滤膜（0.22μm，针式滤器），水相滤膜（0.22μm）。离心管：50mL聚四氟乙烯离心管，耐有机溶剂。均质机：转速≥10000r/min，可用于样品均质。涡旋振荡器：转速0~3000r/min，连续可调。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz。高速冷冻离心机：转速≥10000r/min，温度可调节（0~4℃）。氮吹仪：可控温（30~60℃），氮气纯度≥99.99%。6仪器与设备超高效液相色谱仪：配备二元高压输液泵、自动进样器、柱温箱，具备梯度洗脱功能。串联质谱仪：配备电喷雾离子源（ESI），可实现正离子/负离子切换扫描，具备多反应监测（MRM）模式。电子天平：精度0.1mg和0.01mg。均质机：转速≥10000r/min。高速冷冻离心机：转速≥10000r/min，温度范围0~4℃。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz。涡旋振荡器：转速0~3000r/min。氮吹仪：可控温，氮气纯度≥99.99%。固相萃取装置：负压或正压型，可调节流速。pH计：精度±0.01。容量瓶：10mL、50mL，玻璃材质，校准合格。移液管：1mL、5mL、10mL，或移液器（0.1~1000μL），校准合格。7样品处理7.1样品采集与保存按照GB/T27607的规定进行样品采集，选取具有代表性的水产品样品（不少于500g），去除不可食用部分（鳞片、内脏、壳、骨等，贝类去除外壳，藻类去除杂质），取可食用部分，用组织捣碎机或均质机均质，制成匀浆，分装于洁净的聚乙烯容器中，密封，标记样品名称、采集日期、采样地点等信息。样品需在0~4℃冷藏保存，24h内完成前处理；若需长期保存，需置于-20℃冷冻保存，保存期不超过7d，解冻后一次性完成检测，不得反复冻融。7.2提取准确称取5.00g（精确至0.01g）样品匀浆，置于50mL离心管中，加入20mL乙腈（或甲醇-乙腈混合液，体积比1:1），加入0.1gEDTA-2Na，涡旋振荡1min，超声提取15min（功率200W，温度25℃±2℃），期间每隔5min涡旋振荡1次，每次30s；加入5g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋振荡2min，充分混匀，置于高速冷冻离心机中，4℃、8000r/min离心10min，吸取上清液至另一洁净离心管中。向残渣中加入15mL乙腈，重复上述提取步骤，离心后吸取上清液，合并两次上清液，置于氮吹仪中，40℃水浴氮吹至近干（约0.5mL），待净化。7.3净化（可选，根据基质复杂度调整）7.3.1固相萃取净化将氮吹至近干的样品溶液，用5mL水（含0.1%甲酸）溶解，涡旋振荡1min，过0.22μm水相滤膜，弃去初滤液，收集续滤液。将C18固相萃取柱（或HLB柱）安装在固相萃取装置上，用5mL甲醇活化，再用5mL水（含0.1%甲酸）平衡；将上述续滤液缓慢注入固相萃取柱，控制流速1~2mL/min，弃去流出液；用5mL水（含0.1%甲酸）淋洗柱子，弃去淋洗液，真空抽干柱子5min；用8mL甲醇（含0.1%甲酸）洗脱，收集洗脱液于氮吹管中，40℃水浴氮吹至干。7.3.2基质分散固相萃取净化（QuEChERS）对于基质较简单的样品（如淡水鱼肌肉），可采用QuEChERS净化：向合并的上清液中，加入100mgPSA（N-丙基乙二胺）、100mgC18和500mg无水硫酸镁，涡旋振荡2min，8000r/min离心10min，吸取上清液，氮吹至近干，备用。7.4复溶将净化后氮吹至干的残渣，加入1.0mL甲醇-水混合液（体积比1:1，含0.1%甲酸），涡旋振荡2min，超声溶解5min，过0.22μm有机相滤膜，收集滤液于进样瓶中，供超高效液相色谱-串联质谱测定。若采用内标法，需在复溶时加入适量内标工作液，使内标物浓度与目标化合物标准工作液中内标浓度一致。7.5空白实验除不称取样品外，其余操作均按照7.2~7.4步骤进行，制备空白样品溶液，用于扣除空白干扰。8仪器条件8.1超高效液相色谱条件色谱柱：C18柱（100mm×2.1mm，1.8μm），或等效色谱柱。柱温：30℃。流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为乙腈（或甲醇），梯度洗脱程序见表1。流速：0.3mL/min。进样量：5μL。洗脱方式：梯度洗脱，确保四种目标化合物与基质干扰峰完全分离。表1梯度洗脱程序时间（min）A相（%）B相（%）流速（mL/min）0.085150.32.085150.35.030700.37.010900.38.010900.38.185150.310.085150.38.2串联质谱条件离子源：电喷雾离子源（ESI），正离子扫描模式（地西泮、氯丙嗪）和负离子扫描模式（甲硝唑、地美硝唑），或根据仪器性能调整为统一扫描模式。离子源温度：150℃。脱溶剂气温度：350℃。脱溶剂气流速：800L/h。锥孔气流速：50L/h。碰撞气：氩气，纯度≥99.999%，碰撞气压0.25MPa。检测模式：多反应监测（MRM），每种目标化合物选择1个母离子和2个特征子离子（1个定量离子，1个定性离子），内标物选择对应特征离子对，优化后的MRM参数见表2（参考值，可根据仪器型号调整）。表2四种目标化合物及内标物的MRM参数（参考值）目标化合物离子源模式母离子（m/z）定量子离子（m/z）定性子离子（m/z）锥孔电压（V）碰撞能量（eV）保留时间（min）甲硝唑ESI⁻171.0128.082.02520/282.8~3.2地美硝唑ESI⁻141.098.061.02218/253.5~3.9地西泮ESI⁺285.1193.1253.13022/186.2~6.6氯丙嗪ESI⁺319.186.1274.13530/257.1~7.5甲硝唑-D4（内标）ESI⁻175.0132.086.02520/282.8~3.2地西泮-D5（内标）ESI⁺290.1198.1258.13022/186.2~6.69测定9.1定性测定按照上述仪器条件，分别进样空白样品溶液、混合标准工作液、样品溶液，进行MRM模式检测。定性鉴别需满足以下条件：样品溶液中目标化合物的保留时间，与混合标准工作液中对应目标化合物的保留时间偏差≤±2.5%。样品溶液中目标化合物的定量子离子与定性子离子的相对丰度，与浓度相近的混合标准工作液中对应离子对的相对丰度偏差，符合表3的规定。空白样品溶液中，在目标化合物的保留时间窗口内，不得出现与目标化合物特征离子对相对应的明显色谱峰（峰高低于标准工作液中对应峰高的10%）。表3定性离子相对丰度偏差允许范围相对丰度（定量离子峰高/定性离子峰高）允许偏差（%）≥50±2020~50±2510~20±30<10±509.2定量测定采用外标法或内标法进行定量测定，根据目标化合物的浓度范围，选择对应的混合标准工作液，绘制标准曲线。9.2.1标准曲线的绘制将配制好的系列浓度混合标准工作液，按照仪器条件依次进样测定，以目标化合物的峰面积（外标法）或目标化合物峰面积与内标物峰面积的比值（内标法）为纵坐标（y），以目标化合物的浓度为横坐标（x，μg/L），绘制标准曲线，进行线性回归，得到回归方程和相关系数（r）。要求相关系数r≥0.995，线性关系良好。9.2.2样品定量将样品溶液和空白加标样品溶液，按照仪器条件进样测定，记录目标化合物的峰面积（外标法）或目标化合物与内标物的峰面积比值（内标法），代入标准曲线回归方程，计算样品溶液中目标化合物的浓度。若样品溶液中目标化合物的浓度超出标准曲线的线性范围，需将样品溶液用甲醇-水混合液（体积比1:1）适当稀释后，重新测定。9.3结果计算样品中目标化合物的残留量（X），按下列公式计算：X=(C×V×f)/(m×1000)式中：X——样品中目标化合物的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；C——由标准曲线计算得到的样品溶液中目标化合物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——样品溶液的最终定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品溶液的稀释倍数（无稀释时f=1）；m——称取样品的质量，单位为克（g）；1000——单位换算系数（1L=1000mL）。计算结果保留三位有效数字，当残留量低于定量限时，报告为“未检出”（检出限≤X<定量限）；当残留量高于定量限时，按实际计算结果报告。10方法验证10.1线性关系在0.1~20μg/L浓度范围内，四种目标化合物的标准曲线相关系数r≥0.995，线性关系良好，满足定量要求。10.2检出限与定量限本方法中，四种目标化合物的检出限（LOD）≤0.05μg/kg，定量限（LOQ）≤0.1μg/kg（以信噪比S/N≥3为检出限，S/N≥10为定量限）。10.3回收率与精密度选取空白水产品样品（鱼类、甲壳类、贝类各1种），分别添加低、中、高三个浓度水平（定量限的1倍、5倍、10倍）的混合标准工作液，每个浓度水平做6个平行样品，按照本方法进行前处理和测定，计算回收率和相对标准偏差（RSD）。回收率：三种浓度水平的平均回收率应在70%~120%之间。精密度：相对标准偏差（RSD）应≤20%（n=6）。10.4基质效应采用空白基质匹配标准曲线法或内标法消除基质效应，基质效应因子（ME）应在80%~120%之间，若基质效应因子超出该范围，需优化净化步骤或采用内标法校正。10.5稳定性考察样品在0~4℃冷藏（24h）、-20℃冷冻（7d）及样品溶液在4℃避光（24h）、室温避光（6h）条件下的稳定性，目标化合物的峰面积变化率≤15%，视为稳定。11质量控制11.1试剂与标准品控制试剂需符合本方法规定的纯度要求，实验前需进行空白验证，确保无目标化合物干扰。标准品需妥善保存，定期核查标准储备液的稳定性，若出现浑浊、沉淀或峰面积变化率>10%，需重新配制。标准曲线需每次实验重新绘制，每批样品测定时，需插入浓度中间点的标准工作液，其测定值与理论值的偏差≤15%，否则需重新绘制标准曲线。11.2样品处理控制样品采集、保存和处理需严格按照本方法规定进行，避免样品污染、变质或目标化合物损失。每批样品（≤20个）需同时制备空白样品、空白加标样品（中浓度水平），空白加标回收率需在70%~120%之间，否则该批样品需重新测定。样品提取、净化、氮吹等步骤需规范操作，氮吹至近干时避免过度吹干，防止目标化合物挥发损失。11.3仪器操作控制仪器需定期校准、维护，确保仪器性能稳定，色谱柱需定期冲洗、活化，避免污染。每次实验前，需用流动相冲洗色谱系统至基线平稳（基线噪声≤1×10⁻⁶AU），质谱仪需进行调谐，确保离子源性能正常。样