鸡蛋中5种全氟化合物含量的测定 高效液相色谱-串联质谱法

鸡蛋中5种全氟化合物含量的测定高效液相色谱-串联质谱法1范围本方法规定了鸡蛋中5种全氟化合物（全氟辛酸PFOA、全氟辛烷磺酸PFOS、全氟壬酸PFNA、全氟癸酸PFDA、全氟十二烷酸PFDoA）含量的高效液相色谱-串联质谱测定方法。本方法适用于鸡蛋（鲜蛋、冷藏蛋）中上述5种全氟化合物含量的定性鉴别和定量测定，检出限为0.05μg/kg，定量限为0.15μg/kg。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB5009.1-2016食品安全国家标准食品卫生检验方法总则GB5009.28-2016食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和脱氢乙酸的测定GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法JJF1059.1-2012测量不确定度评定与表示SN/T2393-2017进出口食品中全氟化合物的测定高效液相色谱-串联质谱法3术语和定义3.1全氟化合物（PerfluorinatedCompounds,PFCs）分子中与碳原子相连的氢原子全部被氟原子取代的有机化合物，具有耐高温、耐酸碱、耐氧化、表面活性高的特性，本次测定涵盖5种常见全氟羧酸类化合物。3.2检出限（LimitofDetection,LOD）在给定的置信水平下，能够检测到但无法准确定量的最低含量，本方法中以信噪比（S/N）≥3时对应的浓度作为检出限。3.3定量限（LimitofQuantification,LOQ）在给定的置信水平下，能够准确定量测定的最低含量，本方法中以信噪比（S/N）≥10时对应的浓度作为定量限。4原理鸡蛋样品经均质、冷冻离心去除脂肪后，用乙腈提取样品中的5种全氟化合物，提取液经固相萃取小柱净化、氮吹浓缩后，采用高效液相色谱分离，串联质谱检测器进行定性和定量分析。通过保留时间和特征离子对进行定性鉴别，外标法计算样品中各目标化合物的含量。全氟化合物具有强疏水性和弱酸性，在反相高效液相色谱条件下，根据其碳链长度差异实现分离；串联质谱中采用电喷雾负离子源（ESI⁻）电离，多反应监测模式（MRM）检测，提高检测的灵敏度和选择性。5试剂与材料5.1试剂除非另有说明，所用试剂均为色谱纯，试验用水为超纯水（符合GB/T6682-2008中一级水规格）。乙腈（CH₃CN）：色谱纯，纯度≥99.9%。甲醇（CH₃OH）：色谱纯，纯度≥99.9%。氨水（NH₃·H₂O）：色谱纯，浓度25%~28%。甲酸（HCOOH）：色谱纯，纯度≥98%。5种全氟化合物标准品：PFOA（纯度≥98%）、PFOS（纯度≥98%）、PFNA（纯度≥98%）、PFDA（纯度≥98%）、PFDoA（纯度≥98%），购自国家标准物质中心或权威试剂厂商。标准储备液：分别准确称取各标准品10.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL，配制成浓度为100μg/mL的标准储备液，置于-20℃冰箱中密封保存，有效期6个月。混合标准中间液：准确移取各标准储备液1.0mL，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成浓度为1.0μg/mL的混合标准中间液，置于4℃冰箱中密封保存，有效期1个月。混合标准工作液：根据检测需求，用甲醇逐级稀释混合标准中间液，配制成浓度为0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50μg/mL的混合标准工作液，现配现用。氨水-甲醇溶液（5:95，v/v）：量取5mL氨水，加入95mL甲醇，混匀后备用。甲酸-水溶液（0.1:99.9，v/v）：量取0.1mL甲酸，加入99.9mL超纯水，混匀后备用。5.2材料固相萃取小柱：WAX固相萃取小柱（60mg/3mL），或等效固相萃取小柱，使用前需活化。离心管：50mL、15mL，聚四氟乙烯（PTFE）材质，无全氟化合物污染。均质机：转速≥10000r/min，可实现样品均匀均质。冷冻离心机：转速≥10000r/min，温度可调节至-4~4℃。氮吹仪：可控温（30~50℃）、可调节氮气流量（0.1~1.0L/min）。移液管：1mL、5mL、10mL，精度≥0.01mL。容量瓶：10mL、50mL、100mL，玻璃材质，无全氟化合物污染。滤膜：0.22μm，有机相滤膜（PTFE材质），使用前用甲醇润洗。样品瓶：2mL，棕色，PTFE材质瓶盖，无全氟化合物污染。6仪器与设备高效液相色谱仪：配备二元梯度泵、自动进样器、柱温箱，可实现梯度洗脱和恒温控制。串联质谱仪：配备电喷雾负离子源（ESI⁻），可实现多反应监测模式（MRM），分辨率≥1000。电子天平：精度0.1mg和0.001g，符合JJF1059.1-2012要求。超声波清洗器：功率≥200W，频率40kHz，用于样品提取辅助。冰箱：-20℃冷冻冰箱、4℃冷藏冰箱，用于试剂和样品保存。固相萃取装置：负压式或正压式，可调节流速（1~5mL/min）。涡旋振荡器：转速≥2000r/min，用于样品和试剂混合。7样品处理7.1样品制备取新鲜鸡蛋样品，去除蛋壳，将蛋清和蛋黄放入均质机中，均质5~10min，直至样品均匀细腻，无明显颗粒和分层，置于50mL离心管中，标记后4℃冷藏保存，24h内完成提取。注：若样品为冷藏蛋，需先置于室温下解冻30min，再进行均质处理；避免样品反复冻融，防止目标化合物损失。7.2脂肪去除准确称取5.00g均质后的鸡蛋样品，置于50mL离心管中，加入10mL超纯水，涡旋振荡1min，使样品充分分散，然后置于-20℃冷冻冰箱中冷冻2h，取出后立即放入冷冻离心机中，4℃、10000r/min离心15min，小心吸取上层脂肪层并弃去，保留下层水相和沉淀部分。7.3提取向上述离心管中加入15mL乙腈，涡旋振荡2min，再置于超声波清洗器中超声提取15min（功率200W，温度25℃），取出后涡旋振荡1min，4℃、10000r/min离心10min，将上清液小心转移至另一50mL离心管中。向残渣中再次加入10mL乙腈，重复上述提取步骤，合并两次上清液，得到提取液。7.4净化将WAX固相萃取小柱安装在固相萃取装置上，依次用5mL甲醇、5mL超纯水活化小柱，活化流速控制在2mL/min，待活化液完全滴尽后，将上述提取液缓慢加载至小柱上，加载流速1mL/min，收集穿透液并弃去。用5mL超纯水冲洗小柱，冲洗流速2mL/min，弃去冲洗液，然后用5mL甲醇冲洗小柱，弃去甲醇冲洗液；最后用5mL氨水-甲醇溶液洗脱小柱，洗脱流速1mL/min，收集洗脱液于15mL离心管中。7.5浓缩与定容将收集的洗脱液置于氮吹仪中，35℃、氮气流量0.5L/min下氮吹至近干（剩余体积约0.1mL），加入1.0mL甲醇，涡旋振荡1min，使残留物充分溶解，然后通过0.22μm有机相滤膜过滤，滤液转移至2mL样品瓶中，供高效液相色谱-串联质谱测定。同时做空白试验：除不加入鸡蛋样品外，其余操作均按照7.1~7.5步骤进行，得到空白样品溶液。8仪器参考条件8.1高效液相色谱条件色谱柱：C18反相色谱柱（2.1mm×150mm，1.7μm），或等效色谱柱。柱温：35℃，恒温控制。流动相：A相为甲酸-水溶液（0.1:99.9，v/v），B相为乙腈。梯度洗脱程序：0~2min，30%B；2~8min，30%B→80%B；8~12min，80%B→95%B；12~15min，95%B；15~16min，95%B→30%B；16~20min，30%B（平衡色谱柱）。流速：0.3mL/min。进样量：10μL。进样器温度：4℃。8.2串联质谱条件离子源：电喷雾负离子源（ESI⁻）。电离电压：-4500V。离子源温度：500℃。雾化气压力：0.35MPa。气帘气压力：0.25MPa。碰撞气：氮气，压力0.15MPa。检测模式：多反应监测模式（MRM），各目标化合物的MRM参数见表1。目标化合物保留时间（min）母离子（m/z）定量子离子（m/z）定性子离子（m/z）碰撞能量（eV）去簇电压（V）全氟辛酸（PFOA）7.8~8.2413.0369.0313.018-80全氟辛烷磺酸（PFOS）8.5~8.9499.080.0419.035-100全氟壬酸（PFNA）9.2~9.6463.0419.0363.020-85全氟癸酸（PFDA）10.5~10.9513.0469.0413.022-90全氟十二烷酸（PFDoA）12.8~13.2613.0569.0513.025-95注：表中保留时间和质谱参数仅为参考，可根据仪器型号和色谱柱类型进行适当调整，以获得最佳分离效果和检测灵敏度。9测定9.1定性测定按照上述仪器参考条件，分别对空白样品溶液、混合标准工作液、样品处理液进行测定，根据以下条件进行定性鉴别：样品处理液中目标化合物的保留时间，与混合标准工作液中对应目标化合物的保留时间偏差≤±2.0%。样品处理液中目标化合物的定量子离子与定性子离子的峰面积比，与混合标准工作液中对应目标化合物的峰面积比偏差≤±15%。空白样品溶液中，不得出现与目标化合物保留时间一致、且峰面积大于定量限对应峰面积1/2的色谱峰，否则需排查污染来源并重新测定。只有同时满足上述条件，才能确认样品中存在该目标化合物。9.2定量测定按照仪器参考条件，对混合标准工作液进行测定，以各目标化合物的浓度为横坐标（x，μg/mL），对应的定量子离子峰面积为纵坐标（y），绘制标准工作曲线，计算回归方程和相关系数（r）。要求相关系数r≥0.999，否则需重新配制标准工作液并测定。在相同条件下，测定样品处理液中各目标化合物的定量子离子峰面积，代入回归方程，计算样品处理液中各目标化合物的浓度，再根据样品称样量、提取体积和定容体积，计算样品中各目标化合物的含量。若样品处理液中目标化合物的浓度超过混合标准工作液的最高浓度，需用甲醇适当稀释后重新测定，稀释倍数需计入计算。10结果计算与表示10.1结果计算样品中各全氟化合物的含量按以下公式计算：X=式中：X——样品中目标化合物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；C——样品处理液中目标化合物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；C₀——空白样品溶液中目标化合物的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V——样品处理液的定容体积，单位为毫升（mL）；f——样品的稀释倍数（未稀释时f=1）；m——样品的称样量，单位为克（g）；1000——单位换算系数。计算结果保留两位有效数字，若计算结果小于定量限，以“<0.15μg/kg”表示。10.2结果表示平行测定两份样品，两份样品的测定结果相对偏差≤15%，取两份样品的平均值作为最终测定结果；若相对偏差>15%，需重新取样测定。11精密度与准确度11.1精密度在重复性条件下，对同一鸡蛋样品进行6次平行测定，各目标化合物的相对标准偏差（RSD）应≤10%；在再现性条件下，不同实验室对同一鸡蛋样品进行测定，各目标化合物的相对标准偏差（RSD）应≤15%。11.2准确度向空白鸡蛋样品中添加低、中、高三个浓度水平的混合标准工作液（添加浓度分别为0.15μg/kg、0.50μg/kg、1.00μg/kg），进行加标回收试验，各目标化合物的加标回收率应在80%~110%之间。12检出限与定量限本方法中5种全氟化合物的检出限（LOD）均为0.05μg/kg，定量限（LOQ）均为0.15μg/kg。当样品中目标化合物的含量低于检出限时，以“未检出”表示；介于检出限和定量限之间时，以“<0.15μg/kg”表示；高于定量限时，按10.1条公式计算并表示结果。13注意事项试验所用器皿（离心管、容量瓶、样品瓶等）均需用甲醇浸泡30min，再用超纯水冲洗3次，晾干后使用，避免器皿污染导致测定结果偏高。全氟化合物具有强吸附性，试验过程中应尽量减少样品与玻璃器皿的接触时间，优先使用PTFE材质器皿；固相萃取小柱的活化、加载、洗脱过程需控制流速，避免流速过快导致吸附不完全或洗脱不充分。标准试剂应密封保存于-20℃冰箱中，避免光照和高温，混合标准工作液现配现用，防止目标化合物降解。氮吹浓缩过程中，温度不宜过高（不超过40℃），氮气流量不宜过大，避免目标化合物挥发损失；浓缩至近干即可，不可完全吹干，防止残留物难以溶解。试验过程中使用的乙腈、甲醇等有机溶剂具有挥发性和毒性，应在通风橱中操作，佩戴手套、口罩等防护用品，避免接触皮肤和吸入蒸汽。空白试验中