CN119015401B 一种基于rna的肿瘤疫苗、制备方法、免疫佐剂及应用 （浙江大学）

LinlingJu.CircGPC3hepatocellularcarcinomaprogmetastasisbyspongiexpression.ScientificRepo页.本发明提供一种基于RNA的肿瘤疫苗、制备苗包括能编码免疫原性多肽的环状RNA。所述环状RNA被配置为能够特异性编码免疫原性多肽GPC3。本发明中的circ_GPC3其共价闭环结构可2免疫原性多肽GPC3的环状RNA；所述环状RNA被配置为能够特异性编码免疫原性多肽GPC3；所述肿瘤疫苗对编码免疫原性多肽GPC3的RNA序列引入核糖体进入位点IRES修饰；修饰后2.根据权利要求1所述的一种基于RNA的肝（2）取纯化后circRNA用柠檬酸_柠檬酸钠缓冲液稀释，得到含circRNA核酸分子的水4.根据权利要求1所述的一种基于RNA的肝细胞癌特异性肿瘤疫苗在制备肝细胞癌特3前研究报道针对新冠病毒的circRNA疫苗发挥了较mRNA更好的免疫保护作用，但目前尚未[0003]Toll样受体(Toll_likereceptors)激动剂是极具潜力的一类药物，可以高效地激活抗原呈递细胞产生特异性免疫反应，但是现有技术中临床治疗效果并不是非常理想，子蛋白表现出很强的亲和力，但由于它们可以诱导肝脏的单核细胞和DC细胞产生丰富的4[0015]TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAAATGGCCGGGACCGTGCGCACCGCGTGCTTGCTGGTGGCGATGCTGCTAGGCTTGGGCTGCCTGGGACAGGCGCAGCCCCCGCCGCCTCCAGACGCCACCTGTCACCAGGTCCGTTCTTTCTTCCAGAGACTGCAGCCCGGACTCAAATGGGTTCCAGAAACCCCTGTACCAGGATCAGATTTGCAAGTATGTCTCCCCAAGGGCCCAACATGCTGCTCAAGAAAGATGGAAGAAAAATACCAACTAACAGCACGGCTGAACATGGAACAACTGCTCCAGTCTGCGAGTATGGAACTCAAGTTCTTAATTATTCAGAATGCTGCGGTTTTCCAAGAGGCCTTTGAAATTGTTGTTCGCCATGCCAAGAACTACACCAACGCCATGTTCAAGAATAACTACCCCAGCCTGACTCCACAAGCTTTTGAGTTTGTCGGTGAATTTTTCACAGATGTGTCTCTCTACATCTT5GGGTTCTGATATCAACGTGGATGATATGGTCAATGAATTGTTCGACAGCCTCTTTCCAGTCATCTACACCCAGATGATGAACCCAGGCCTGCCTGAGTCAGTCTTAGACATCAACGAGTGCCTCCGAGGAGCAAGACGTGACCTGAAAGTATTTGGCAGTTTCCCCAAGCTTATTATGACCCAGGTTTCCAAGTCACTGCAAGTCACTCGAATCTTCCTTCAAGCCCTGAATCTCGGAATTGAAGTCATCAACACTACCGACCACCTCAAGTTTAGTAAGGACTGTGGCCGTATGCTCACCCGAATGTGGTATTGCTCTTACTGCCAGGGACTGATGATGGTTAAGCCTTGCGGTGGTTATTGCAATGTGGTCATGCAAGGCTGTATGGCTGGTGTGGTGGAGATCGACAAGTACTGGAGAGAATACATTCTGTCTCTTGAAGAGCTCGTGAATGGCATGTACAGAATCTACGACATGGAGAATGTGCTGCTCGGCCTCTTTTCTACCATCCATGATTCCATCCAGTATGTGCAGAAGAACGGAGGCAAGCTGACCACCACCATTGGCAAGTTGTGTGCCCACTCCCAGCAACGCCAATATAGATCTGCTTATTACCCTGAAGATCTGTTTATTGACAAGAAGATATTAAAAGTCGCTCATGTCGAACATGAAGAAACCTTATCCAGCCGAAGAAGGGAACTGATTCAGAAACTGAAGTCTTTCATCAACTTCTATAGCGCTTTGCCGGGCTACATCTGCAGCCATAGCCCCGTGGCCGAAAATGATACCCTGTGCTGGAACGGACAAGAACTTGTGGAGAGATACAGCCAGAAGGCGGCAAGGAACGGGATGAAGAATCAGTTTAACCTCCATGAGCTGAAAATGAAGGGCCCTGAGCCGGTGGTTAGCCAGATCATTGACAAACTGAAGCACATTAACCAGCTCCTGAGAACCATGTCTGTGCCCAAGGGTAAAGTTCTGGATAAAAGCCTGGATGAAGAAGGACTTGAAAGTGGAGACTGCGGTGATGATGAAGATGAATGCATTGGAAGCTCTGGTGACGGGATGGTGAAAGTGAAGAATCAACTGCGCTTCCTTGCAGAACTGGCCTATGATCTGGATGTGGACGATGCTCCGGGGAACAAGCAGCATGGAAATCAGAAGGACAACGAGATCACCACCTCTCACAGCGTGGGGAACATGCCGTCCCCACTGAAGATCCTCATCAGTGTGGCCATCTATGTGGCGTGCTTTTTTTTCCTGGTGCACT[0018]MAGTVRTACLLVAMLLGLGCLGQAQPPPPPDATCHQVRSFFQRLQPGLKWVPETPVPGSDLQVCLPKGPTCCSRKMEEKYQLTARLNMEQLLQSASMELKFLIIQNAAVFQEAFEIVVRHAKNYTNAMFKNNYPSLTPQAFEFVGEFFTDVSLYILGSDINVDDMVNELFDSLFPVIYTQMMNPGLPESVLDINECLRGARRDLKVFGSFPKLIMTQVSKSLQVTRIFLQALNLGIEVINTTDHLKFSKDCGRMLTRMWYCSYCQGLMMVKPCGGYCNVVMQGCMAGVVEIDKYWREYILSLEELVNGMYRIYDMENVLLGLFSTIHDSIQYVQKNGGKLTTTIGKLCAHSQQRQYRSAYYPEDLFIDKKILKVAHVEHEETLSSRRRELIQKLKSFINFYSALPGYICSHSPVAENDTLCWNGQELVERYSQKAARNGMKNQFNLHELKMKGPEPVVSQIIDKLKHINQLLRTMSVPKGKVLDKSLDEEGLESGDCGDDEDECIGSSGDGMVKVKNQLRFLAELAYDLDVDDAPGNKQHGNQKDNEITTSHSVGNMPSPLKILISVAIYVAC[0020]本发明的第二方面，本发明提供一种Toll样受体激动剂在制备基于RNA的肿瘤疫6译蛋白效率进一步提高，本发明首次发现包含环状RNA分子的制剂可显著抑制肿瘤患者体7[0041]图3是实施例2中分别在两种肝癌细胞株中检测mRNA_GPC3和circRNA_GPC3编码多[0044]图6是实施例6中应用编码GPC3的circRNA疫苗联合各类TLR激动剂治疗在肝癌模[0045]图7是实施例6中应用编码GPC3的circRNA疫苗联合各类TLR激动剂治疗在肝癌模[0046]图8是实施例6中应用编码GPC3的circRNA疫苗联合TLR4激动剂治疗在肝癌模型中[0047]图9是实施例6中应用编码GPC3的circRNA疫苗联合TLR4激动剂治疗在肝癌模型中[0048]图10是实施例6中验证circRNA疫苗联合TLR4激动剂治疗激活抗肿瘤免疫反应[0049]图11是实施例6中验证circRNA疫苗联合TLR4激动剂治疗激活抗肿瘤免疫反应[0057]本实施例提供本发明所述的肿瘤疫苗中含有RNA核酸分子的脂质纳米颗粒的制备用无水乙醇溶解后，按表2所示的摩尔百分比配置成脂质乙醇溶液备用。然后，取纯化后8有机相和含有核酸分子(mRNA/circRNA)的水相(柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液(pH＝4.5)稀释)中的总蛋白。通过WesternBlot实验，验证mRNA/circRNA所编码的蛋白。结果表明，circGPC3具有编码多肽的功能，并且所编码的多肽在肝癌细胞中表达量明显高于mRNA‑荧光蛋白EGFP的mRNA‑GPC3‑EGFP@LNP或circGPC3‑EGFP@LNP转染细胞，在细胞转染24小时[0066]对于hepa1‑6肿瘤模型小鼠，分别尾静脉注射10ug编码荧光素酶(firefly剂组；⑦CircGPC3@LNP+TLR9激动剂组。通过腹腔注射给予TLR激动剂，通过瘤内接种9冷冻备用，用于常规生化评估。通过H&E染色法分析各主要脏器的病理情况以及血清ALT/[0072]上面结合附图对本发明进行了示例性的描述，但本发明的保护范围并不局限于