(5.2.6)-5.2.6 光遗传技术(完)

光遗传技术01光遗传技术的概念0203光遗传学的原理光遗传技术的应用目录光遗传技术的概念及原理第一章光遗传技术（optogenetics）是指结合微生物视蛋白工程学与分子基因方法，光控激活或抑制活体组织中的特定类型细胞功能的一项生物学技术，具有可操作性好、实时可逆、定位精准、对细胞组织无创伤等优势。又称光刺激基因工程（opticalstimulationplusgeneticengineering），是一种通过光学和遗传学技术在活体动物脑内精准控制细胞行为的技术。“2010年，光遗传学技术荣膺NatureMethods年度生命科学技术。2010年，被Science认为是近十年的突破之一。光遗传学技术再次被NatureMethods评为2016年最值得关注的八项技术之一。”光遗传技术的概念在神经元细胞中，细胞膜去极化后会出现动作电位。反之，细胞膜超极化则会抑制峰电位的出现。在神经元细胞中表达可以改变膜电位的外源性光敏蛋白编码基因，就能够通过光控操作来控制峰电位开关。(图1）光遗传学利用细菌/绿藻视通道蛋白，使某一特定类型的神经元被激活或抑制，从而特异性地调节这些神经元的活动。（图1）光遗传技术的原理这类对光敏感的蛋白根据不同的作用可以分为兴奋性光敏感蛋白和抑制性光敏感蛋白。视紫红质２（Channelrhodopsin-２，ChR２)是目前最常用的兴奋性光敏感蛋白，它能够被蓝光激活，阳离子内流使细胞去极化，产生动作电位，提高细胞的兴奋性。盐细菌视紫红质（Natronomonaspharaonishalorhodopsins，NpHRs)是一种常见的抑制性光敏感蛋白，在被黄光激活后氯离子泵入细胞，引起细胞膜超极化，从而抑制细胞的兴奋。根据光敏感蛋白的不同特性，需要寻找合适的光敏蛋白；将遗传信息传递给靶细胞：一般通过病毒转导、转基因动物等方式将光敏蛋白的遗传信息传递给靶细胞；其中AAV病毒因其血清型众多，免疫原性低，且有良好的脑组织嗜性等特点，成为光遗传学中的重要工具；可控性演示：即通过导入光纤、控制激光来实现对神经元活动的精确控制；实验方法的有效性验证：一般采用电极记录神经元细胞膜内外电压变化，以此来验证光遗传的有效性；表型检测：通过行为学测试来评估神经元活动对动物行为的影响。光遗传技术的步骤光遗传学的实验步骤光遗传技术在针灸研究中的应用第二章针刺疗法是通过物理刺激躯体腧穴从而治疗疾病的一种疗法。近年来已有大量实验研究运用电生理、分子生物学、脑成像等技术揭示了针刺起效的神经机制，但目前对经穴效应的神经解剖机制及针刺信号如何从穴区传入并传递至中枢，又如何到达靶器官的神经通路研究深入不够，且运用化学药物或电、磁刺激调控神经细胞具有精确度不高、损伤大、实效性差等问题。因此，在当前研究基础上，运用光遗传技术进行针刺效应研究具有良好的应用前景。针灸研究中光遗传学技术的应用光遗传学激活躯体感觉皮层（somatosensorycortex，SSC）逆转电针对慢性炎症性疼痛小鼠模型产生的镇痛效应。针灸研究中光遗传学技术的应用针灸研究中光遗传学技术的应用[1]王馨悦,翁志军,刘慧荣,等.vlPAG中GABA能神经元参与电针缓解IBS小鼠内脏痛的机制研究[J].天津中医药大学学报,2023,42(05):594-599.针灸研究中光遗传学技术的应用针刺效应的产生途径研究针刺效应的产生，需要明确刺激区域与目标靶器官的神经联络机制，而针刺效应机制通常较复杂，每条神经环路均涉及多个效应器官，传统研究方式很难明确针刺与产生效应之间的因果关系。运用光遗传学技术，可以特异性的标记特定神经元细胞，通过对比光控效应和针刺效应，就可以明确针刺是否真正通过激活该神经元而产生生物学效应。由此可见，光遗传学具有高精确度、特异性标记、可重复操作等特点，可以作为针刺脑效应机制研究的对照研究，能够直观地展示针刺效应的因果关系。针灸研究中光遗传学技术的应用低频电针刺激激活了小鼠足三里穴区前动力蛋白受体2-环化重组酶（prokineticinreceptor2-Cre，PROKR2-Cre）标记的神经元，从而刺激迷走神经-肾上腺轴发挥了抗炎作用。当运用光遗传学手段，特异性标记PROKR2-Cre神经元时，用蓝光刺激所产生的抗炎效应与针刺效应基本相当。同时研究发现，小鼠足三里穴和天枢穴分布的PROKR2-Cre神经元数量有显著差异，因此电针足三里能够通过激活PROKR2-Cre神经元从而起到抗炎作用，而天枢不能。该研究为穴位特异性提供了很好的思路。针灸研究中光遗传学技术的应用穴位特异性作用传统针灸学建立在经络腧穴理论上，是古代医家通过长期临床总结得出的宝贵经验，但长期以来，经络和穴位的存在却一直受到国外学者的质疑，甚至发展出以现代解剖学为基础的干针疗法，是对传统针灸发展的一种冲击。因此，针对穴位特异性的研究迫在眉睫。通过光遗传学与神经示踪、电生理等技术的结合，可以更加直地反映大脑不同核团、不同神经元群体及不同的环路在针刺信号中的作用。并且由于光遗传学具有可逆性，通过对同一个体特定神经元或细胞实现光控“开”“关”，观察操作前后的针刺效应变化，可排除个体间差异的影响，对穴位特异性的研究意义重大。针灸研究中光遗传学技术的应用针刺刺激参数研究针刺的刺激形式多样，常用的两种为电针和手针刺激，电针主要由不同频率控制，而手针又有各种补泻手法的区别，当前研究认为，手针和电针因兴奋的神经纤维不同具有疗效差异，通常电针主要兴奋较粗的Ⅰ~Ⅱ类纤维，而手针可以兴奋全部Ⅰ~Ⅳ类纤维[3]。由于电针数据的标准化可控，目前针刺实验研究多采用电针，但临床上电针的应用相较手针并不广泛，这就造成了针刺实验研究结果与临床转化脱节的问题。因此，有必要进一步开展对不同针刺刺激形式所产生不同生物学效应的机制研究。利用光遗传学技术标记特定神经元细胞，结合钙离子成像技术，实现对同一个体在体、实时、动态的观测，可以考虑对同一实验动物前后使用电针和手针两种针刺形式，观察其神经元和神经环路的活动差异，来对比不同刺激形式产生的针刺效应。同时，运用光遗传技术还能够直观观察到针刺刺激量的累积和消减，为针刺的标准化研究提供了可能。针灸研究中光遗传学技术的应用总结第三章①能够控制光照时间，从而使细胞功能控制精确到毫秒甚至微秒级别②通过控制光的强度，可瞬时控制刺激强度③脑注射特异性启动子可将光敏蛋白精确到某个细胞或细胞器，实现精准控制细胞活动，在清醒动物上具有时间精准性光遗传学技术具有对神经元或细胞进行非侵入式精确定位刺激操作的优势，成功实现了神经网络活动同步观测与调控，能够精确解析多种疾病的病理机制。应用光遗传学技术能够有效解决传统针刺研究无法在活体动物中进行，不能够实时精确的对细胞进行调控等问题，为探究针刺效应途径和穴位特异性提供了强有力的科学证据，并为针刺参数等方面的研究提供了新思路。光遗传技术的优势总结光纤的插入会对脑组织造成一定损伤，长期植入后可形成机化包裹使光控强度减弱，并且动物的自由活动也会受到所连接光纤的限制，需要开发具有远程控制功能的无线光源植入物以降低侵入性；光敏蛋白的