NYT 4741-2025 牛曼氏杆菌病诊断技术标准立项发展报告

牛曼氏杆菌病诊断技术标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:DiagnosticTechniquesforBovineMannheimiosis摘要牛曼氏杆菌病（BovineMannheimiosis）是由溶血性曼氏杆菌（*Mannheimiahaemolytica*）引起的一种严重危害养牛业的重要细菌性传染病，以纤维素性肺炎和败血症为主要临床特征，给全球养牛产业造成巨大的经济损失。随着我国畜牧养殖业规模化、集约化程度的不断提高，牛呼吸道疾病综合征（BRDC）的防控形势日趋严峻，对牛曼氏杆菌病的快速、精准诊断提出了更高要求。然而，我国长期以来缺乏统一的牛曼氏杆菌病诊断技术行业标准，导致各地在病原分离鉴定、血清学检测和分子生物学诊断等方面操作流程不一、结果判定标准各异，严重影响了疫病监测和防控工作的规范化开展。在此背景下，农业农村部畜牧兽医局组织相关科研单位，依据《中华人民共和国动物防疫法》和《农业标准化管理办法》等法律法规，制定了农业行业标准NY/T4741-2025《牛曼氏杆菌病诊断技术》。该标准于2025年4月27日发布，并将于2025年8月1日正式实施。本标准系统规定了牛曼氏杆菌病的病原分离与鉴定、聚合酶链式反应（PCR）检测、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）等技术操作的规范化流程和结果判定标准，填补了我国在该领域行业标准的空白。本报告的发布将为该标准的推广应用提供重要参考，对提升我国牛曼氏杆菌病综合防控能力、保障肉牛和奶牛产业健康发展具有重要意义。关键词：牛曼氏杆菌病；溶血性曼氏杆菌；诊断技术；行业标准；聚合酶链式反应；酶联免疫吸附试验；疫病防控Keywords:BovineMannheimiosis;*Mannheimiahaemolytica*;DiagnosticTechniques;IndustryStandard;PolymeraseChainReaction(PCR);Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA);DiseasePreventionandControl一、引言1.1标准立项背景牛曼氏杆菌病是由溶血性曼氏杆菌感染引起的一种重要牛科动物传染病，其病原属于巴斯德菌科（Pasteurellaceae）曼氏杆菌属（*Mannheimia*）。该病在全球范围内广泛分布，是牛呼吸道疾病综合征（BovineRespiratoryDiseaseComplex,BRDC）的首要病原之一，在运输、饲养密度过高、气候剧变等应激因素诱导下极易暴发流行。病牛主要表现为急性纤维素性肺炎、胸膜肺炎或败血症，发病急、病程短、死亡率高，对肉牛育肥场和奶牛养殖场造成严重的经济损失。近年来，随着我国畜牧业产业结构调整步伐加快，肉牛和奶牛养殖规模持续扩大，跨区域调运日益频繁，牛曼氏杆菌病的发生和传播风险明显上升。然而，在NY/T4741-2025标准发布之前，我国尚无针对牛曼氏杆菌病诊断技术的专项行业标准，各地兽医实验室在病原分离培养、生化鉴定、血清学检测及分子生物学诊断等方面操作方法不一、判定标准各异，检测结果缺乏可比性，给疫病监测、流行病学调查及口岸检疫等工作带来较大困扰。1.2编制目的与意义制定《牛曼氏杆菌病诊断技术》行业标准，旨在建立一套科学、规范、统一的牛曼氏杆菌病诊断技术体系，明确病原分离鉴定、分子生物学检测和血清学检测等各项技术的操作程序和判定标准，为各级动物疫病预防控制机构、兽医实验室及相关检测单位提供统一的技术依据。本标准的制定和实施，对于规范我国牛曼氏杆菌病诊断工作、提高疫病检测的准确性和可比性、完善动物疫病诊断标准体系、促进养牛业健康发展均具有重要意义。二、标准编制依据与原则2.1法律法规与政策依据本标准的编制严格遵循以下法律法规和政策文件：-《中华人民共和国动物防疫法》（2021年修订）-《农业标准化管理办法》-《兽药管理条例》-《国家动物疫病防治中长期规划（2012—2020年）》及后续衔接文件-《全国畜禽遗传资源保护和利用规划》相关政策2.2技术依据本标准的编制充分参考和借鉴了以下国内外相关标准和技术资料：-世界动物卫生组织（WOAH，原OIE）《陆生动物诊断试验和疫苗手册》中关于牛曼氏杆菌病的相关技术规范-国际标准化组织（ISO）发布的兽医微生物学检测相关标准-我国现行有效的动物疫病诊断技术国家标准（GB/T系列）-已发布的兽病诊断相关农业行业标准（NY/T系列），如NY/T546-2002《牛呼吸系统疾病防治技术规范》等-国内外近十年发表的相关研究文献和技术报告2.3编制原则本标准编制遵循以下原则：（1）科学性：各项技术内容均以充分的科学研究和实践验证为基础，确保标准技术指标的准确性和可靠性；（2）实用性：充分考虑我国各级兽医实验室的实际条件和操作水平，确保标准规定的技术方法具有可操作性和推广适用性；（3）协调性：与我国现行有效的相关法律法规、技术标准保持协调一致，同时注重与国际通行规则接轨；（4）规范性：严格按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定进行编写。三、标准主要技术内容3.1标准适用范围本标准规定了牛曼氏杆菌病的诊断技术程序，适用于牛曼氏杆菌病的临床诊断、疫病监测、流行病学调查、产地检疫及边境口岸检疫等工作中对牛曼氏杆菌病的诊断和确认。标准适用的样品类型包括鼻拭子、肺组织、胸腔渗出液、心血、肝脾等实质脏器组织及血清样品。3.2主要技术路线本标准规定了三种主要的诊断技术方法，涵盖了从病原学检测到血清学检测的完整技术体系：（1）病原分离与鉴定病原分离鉴定是牛曼氏杆菌病确诊的“金标准”方法。标准详细规定了样品的采集、保存和运输要求，分离培养所用的培养基配方（含5%绵羊血的哥伦比亚血琼脂平板或胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）血平板），培养条件（37℃、5%CO₂环境培养18~24小时），以及典型菌落的形态特征（灰白色、圆形、直径1~2mm、β溶血环明显）。标准还规定了基于生化特性（氧化酶阳性、吲哚阴性、尿素酶阴性等）和革兰氏染色形态（革兰氏阴性短杆菌，两极浓染）的初步鉴定方法，以及采用特异性基因检测进行最终确认的技术要求。（2）聚合酶链式反应（PCR）检测PCR检测技术作为快速、灵敏的分子生物学诊断方法，是本标准推荐的首选快速诊断手段。标准详细规定了针对溶血性曼氏杆菌特异性靶基因（如*lktC*基因或*rpt2*基因）的引物序列、PCR反应体系（各组分浓度及用量）、扩增程序（预变性、变性、退火、延伸及终延伸的温度和时间参数）、产物电泳检测方法及结果判定标准。同时，标准对核酸提取方法、阳性和阴性对照设置、实验室防污染措施等技术细节作出了明确规定，确保检测结果的可靠性和实验室生物安全。（3）间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）间接ELISA方法适用于牛群感染状况的血清学调查和疫苗免疫效果评估。标准规定了抗原包被浓度、血清样品稀释倍数、酶标二抗的工作浓度、显色反应条件（底物溶液、反应时间和终止方法）以及酶标仪读数波长的设定等技术参数，并明确了阳性判定标准（通常以OD值≥临界值或S/P值≥0.5为阳性判定线）。3.3结果判定标准本标准明确了各诊断方法的综合判定标准：-确诊标准：病原分离鉴定阳性，或PCR检测阳性，或病原分离与PCR检测同时为阳性，即可确诊为牛曼氏杆菌病；-疑似标准：间接ELISA检测阳性，但未进行病原分离或PCR检测的，判定为疑似感染，需结合流行病学资料和临床症状综合判断，必要时进行病原学确认；-阴性判定：上述检测方法结果均为阴性的，判定为未感染。3.4生物安全要求标准还规定了诊断操作中的生物安全要求，包括实验室生物安全等级要求（病原分离鉴定应在生物安全二级（BSL-2）实验室进行）、实验废弃物无害化处理方法、操作人员个人防护要求等，确保检测工作安全有序开展。四、主要编制单位简介4.1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所本标准的主要起草单位之一为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（以下简称“哈兽研”）。哈兽研成立于1948年，隶属于中国农业科学院，是我国历史最悠久的兽医科研机构之一，也是国家动物疫病防控领域的重要战略科技力量。哈兽研设有兽医生物技术国家重点实验室、国家牛传染性胸膜肺炎参考实验室、国家禽流感参考实验室等多个国家级科研平台，在牛重大传染病病原生物学、流行病学、诊断技术与疫苗研发等领域具有深厚的科研积淀。研究所在牛呼吸道疾病病原的分离鉴定、分子流行病学研究和快速诊断技术开发方面开展了大量系统性工作，建立了完善的牛曼氏杆菌菌株资源库和诊断技术平台，为本标准的编制提供了坚实的技术支撑和丰富的实践数据。近年来，哈兽研先后承担了国家重点研发计划、国家自然科学基金、国家现代农业产业技术体系（肉牛牦牛体系、奶牛体系）等多项国家级科研项目，在牛曼氏杆菌病的病原学特征、致病机理、耐药性分析及新型诊断技术研发等方面取得了一系列重要成果，相关研究成果发表在*VeterinaryMicrobiology*、*FrontiersinVeterinaryScience*、*畜牧兽医学报*等国内外权威学术期刊上。哈兽研牵头或参与制修订国家标准和农业行业标准数十项，是我国动物疫病诊断标准制定的核心力量之一。在本标准编制过程中，哈兽研团队负责病原分离鉴定技术方案的制定与验证、PCR检测方法的优化与协同试验组织、标准文本的起草与修改完善等工作，为标准的科学性、先进性和适用性提供了有力保障。五、标准实施意义与应用展望5.1标准实施的意义NY/T4741-2025《牛曼氏杆菌病诊断技术》的实施，将产生显著的社会效益和经济效益：（1）填补标准空白，完善标准体系该标准填补了我国牛曼氏杆菌病诊断领域行业标准的空白，与已发布的牛结核病诊断技术（NY/T572）、牛病毒性腹泻/黏膜病诊断技术（NY/T575）等标准共同构成较为完善的牛病诊断标准体系，为牛疫病综合防控提供了更全面的技术支撑。（2）规范诊断操作，提升检测质量统一的技术操作流程和结果判定标准，有助于消除不同实验室之间的检测差异，提高检测结果的准确性和可比性，为疫病监测和流行病学调查提供可靠的数据基础。（3）支撑疫病防控，保障产业发展规范的诊断技术有利于实现牛曼氏杆菌病的早发现、早报告、早处置，有效降低发病率和死亡率，减少抗生素使用，保障肉牛和奶牛产业的健康稳定发展，维护食品安全和公共卫生安全。（4）促进国际贸易，降低检疫风险标准化的诊断技术为我国牛及牛产品进出口贸易中的疫病检疫提供了明确的技术依据，有助于打破技术性贸易壁垒，促进国际贸易的健康发展。5.2未来展望展望未来，牛曼氏杆菌病诊断技术的发展将呈现以下趋势：（1）分子诊断技术的迭代升级随着实时荧光定量PCR（qPCR）、重组酶聚合酶扩增（RPA）、环介导等温扩增（LAMP）以及CRISPR-Cas等新型分子诊断技术的日益成熟，牛曼氏杆菌病的现场快速检测将成为可能。后续标准修订中可适时纳入更多快速、便捷、灵敏的新型检测方法，满足基层现场检测和移动检疫的实际需求。（2）高通量检测与多病原联检针对牛呼吸道疾病综合征多病原混合感染频发的现状，基于微流控芯片和液相芯片技术的高通量多病原联合检测方法将逐步得到应用。未来的标准修订可考虑建立多种呼吸道病原体同步检测的技术规范，为临床混合感染诊断提供更加全面的技术手段。（3）标准化体系的持续完善随着对牛曼氏杆菌病认识的不断深入和诊断技术水平的持续提升，该标准将根据实际应用情况和反馈意见适时进行复审和修订，以确保其技术内容的先进性和适用性。建议建立标准实施效果评估机制，定期收集使用单位和行业专家的反馈意见，为标准的后续修订完善提供依据。六、结论NY/T4741-2025《牛曼氏杆菌病诊断技术》是我国首项专门针对牛曼氏杆菌病诊断的农业行业标准，将于2025年8月1日起正式实施。该标准的发布填补了我国在该领域标准化工作的空白，构建了涵盖病原分离鉴定、PCR检测和间接ELISA检测的综合性诊断技术体系，为牛曼氏杆菌病的临床诊断、疫情监测、流行病学调查和口岸检疫提供了统一、科学、规范的技术依据。标准编制过程中充分参考了世界动物卫生组织（WOAH）的相关技术规范和国际前沿研究成果，紧密结合我