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DB34DB34/T3308—2018两系杂交水稻种子纯度检测分子标记法Protocolforpuritydetectionoftwo-linehybridseeds-molecularmarkermethod2018-12-29发布2019-01-29实施安徽省市场监督管理局发布I1GB/T3543.2农作物种子检验规GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性GB/T6682分析实验室用水规CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，DNA：deoxyribonucleicaciddNTPs：deoxyribonucleosidetriphoPAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚PCR：polymerasechainreaction，聚合SSR：simplesequencere具有共显性，杂交种子具有双亲等位标记互补带型，针对不同品种筛选其区别于其它品种的特征SSR标记，通过SSR多态性分析，可判断受检种子是否为杂交种并区别正常个体与异品种个体。本标准综合利用两系不育基因特征标记和不同品种特征SSR标记，鉴定一定数量送验样品中的正常个体数目或2高压灭菌锅、超纯水仪、高速离心机、恒温水浴锅（30℃~100℃)、核酸蛋白测定仪、组织研磨去离子甲酰胺、溴酚蓝、二甲苯青FF、丙烯酰胺、从送检样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体独立检测。试样的抽取应有代表性，符合试样的检测应设置重复，重复的次数以达到GB/T3543.5规定的容许误差范围内为止，每次重复取待检样品的去壳种子、幼苗或叶片约200～300mg置于2.0mL离心管，充分研磨；每管700µL经65℃预热的CTAB提取液，充分混合，65℃水浴30mi弃上清液，用70％乙醇溶液洗涤2遍；室温自然晾干后，加入超纯水或T3将种子发芽至幼苗长度达到3cm左右时剪取0.5cm长的幼苗，或将田间植株的叶片剪取0.5每个两系杂交水稻品种至少筛选2对引物进行纯度鉴定，包括针对该品种不育基因类型），F:AGGCATGGTGAAGCAAAM:GAAGCAAAGAAATGCATTGTTT4扩增产物加入2L上样指示剂后于4℃保存。涂有剥离硅烷的一面朝下盖于无凹槽玻璃板上，两侧对称拔下玻璃板上的样品梳，用清水洗净点样槽，再将玻璃板装上电泳槽，上下槽右，停止电泳，一次性可检测96×2=192出，在清水中漂洗1分钟左右；最后取出胶板，晾干，放在胶片观察灯下观察，56用TE缓冲液1（或超纯水）分别配制正向7A.3.3亲和硅烷工作液8(资料性附录)溶液原浓

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