细胞培养 中和试验、TCID50原理 方法

实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的

了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特

征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法,，

二、常用细胞的种类

BHK-21：仓鼠肾传代细胞

PK-15：猪肾传代细胞

TBRS-2：猪肾传代细胞

Hela：人的子宫瘤细胞

Vero：非洲绿猴肾细胞

Marc-145：来源于Vero细胞

TK-143：人的胸苜激酶阴性细胞

Sf9：昆虫细胞

三、材料

1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头

2、BHK-21(babyhamsterkidney)细胞

3、0.25%胰酶

4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

维持液:含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液(PRV)

四、传代细胞培养的条件要求

1)细胞密度：2-3X1O'个/ml

2)pH范围最适pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.8

3)培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

五、常用细胞分散剂与作用原理

1、胰酶使精氨酸或赖氨酸的竣基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解,

导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和竣肽

酶的混合物。

六、营养液

1、人工综合营养液

氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、噤吟、喀咤、辅助生长因子。

2、血清

1)血清的种类

胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、

人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2)血清的处理

无菌采集，过滤除菌。用前56cle灭活30min。

3）血清的作用

A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。

D、有中和毒性物质保担细胞不受伤害的作用。

E、给培养液提供良好的缓冲系统。

F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。

4）应用血清存在的问题

A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑

制因子。

B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。

C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七、传代细胞系培养

1、优点：1）可以无限的传代。

2）不少细胞系对病毒很敏感。

3）某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生

产。

4）生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。

2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。

3、培养方法

1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。

2）加入2nli胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞

变圆后，倒去消化液。

3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。

再在每个小瓶中补充生长液至10ml,然后置37℃培养箱培养，培养上2天即可

长成单层。

八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养

1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。

2、加入适量的病毒悬液

3、置温箱中感作（吸附）45min-lho

4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%

以上的细胞病变。

5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中

振摇儿次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器

中。低温贮藏备用。

实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）

一、实验目的

了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。

二、材料

1、9-11日龄鸡胚

2、照蛋灯与蛋座

3、碘酊棉球与酒精棉球

4、大剪子、眼科剪、小镜子

5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、

6、胰酶、生长液、维持液

三、细胞培养的条件要求

1）细胞密度

原代细胞:4-6X105个/1nl

传代细胞：2-3X10'个/ml

2）pH范围最适pH7.0-7.4,耐受pH6.6-7.8

3）培养温度

哺乳动物细胞一般为37℃

昆虫细胞28-30℃

四、操作步骤

1、取9T2日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。

2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚

颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。

3、用眼科剪、镣去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。

4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静

置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。

6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8,振荡混匀

后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组

织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。

7、取出，静置儿分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长

液5ml,用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。

8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

9、细胞计数

取细胞悬液0.5ml+2ml0.现结晶紫一枸椽酸（0.Imol/L）溶液，室温或37℃

温箱中5-10min,充分振荡后进行计数。

按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每ml悬液中的细胞数（n）=N/4X10000XK（稀释倍数）。

活细胞数应在90%以上。

10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6X10,个/nd,分层于

细胞培养瓶中，每瓶1ml,再补加DMEM生长液至10ml,盖上盖子，置于37c

恒温箱中培养。

。表示可计数

・表示不计数

五、结果的观察

于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层,

细胞呈纤维状。

实验四病毒感染力的滴定（TCID5。的测定）

一、实验目的

了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCTDso

的操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力的方法

半数致死量LD/50%lethaldose）：用动物或鸡胚来检测

半数鸡胚感染量EI%（egg50%infectivedose）：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCIDso(50%tissuecultureinfectivedose)：用细胞

来检测

蚀斑形成单位(plaqueformingunit,PFU)：用细胞来检测

三、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液(PRV)

四、TCIDso的操作步骤

1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10L10，

2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔,

每孔接种100闵。

3、在每孔加入细胞悬液100闵，使细胞量达到2~3义ICT个加1°

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。(100H生长液+100川细胞悬液)

5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果的计算,按Reed-Muench两氏法或Karber法

五、TCIDso的计算方法

1、Reed-Muench两氏法

出现CPE累计出现CPE孔所

病毒液稀释度无CPE孔数

孔数CPE孔数无CPE孔数占的用

10180270100(27/27)

1028」0190100(19/19)

1037111191.6(11/12)

104354640(4/10)

10-517、1130.7(1/14)

10飞080210(0/21)

CPE：Cytopathiceffect

距离比例=(高于50蜩变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于

50%病变率的百分数)

=(91.6-50)/(91.6-40)

=0.8

IgTCID市距离比例X稀释度对数之间的差十高于50%病变率的稀释度的对数

二0.8X(-1)+(-3)

=-3.8

-3

TCIDSO=10-70.1ml

含义：将该病毒稀释10-8接种100R可使50%的细胞发生病变。

2、Karber法

病毒液稀释度出现CPE的孔数出现CPE孔的比率

10188/8=1

10188/8=1

城77/8=0.875

10-133/8=0.375

10511/8=0.125

L0600/8=0

lgTCID5o=L-d(s-O.5)

L：最高稀释度的对数

D：稀释度对数之间的差

S：阳性孔比率总和

lgTCIDso=-l-lX(3.375-0.5)

=-3.875

-3875

TCID5O=1O-/O.1ml

含义：将该病毒稀释W接种I。。用可使50%的细胞发生病变。

+1科分6B6

200个TCID5O,殷灵病毛学上介绍的很详细,就是指计算出病韦的TCID50(残麻移现测)，计算出TCIDS0后,除以

200,就是所要桁病毒稀释的倍数，如你的犬瘟淤TQD5O10的4.5次方个TCID50,你则需要将10的45次方除以200,

即为10的2.2次方,即稀1516g即为200TCID50,明白了味?307008942

实验五血清中和试验

一、实验目的

了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒一稀释血清

法的操作步骤和计算方法及含义。

二、原理

抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。

三、用途

1、疾病诊断

2、病毒分高株的鉴定

3、不同病毒株的抗原关系研究

4、疫苗免疫原性的评,介

5、免疫血清的质量评价

6、测定实验动物血清中是否存在抗体

四、分类

（一）蚀斑（痘斑）减数试验

将病毒一正常血清混合物以及病毒一待检血清混合物分别接种到单层细胞

上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒一正常血清组和

病毒一待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。

以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑

减数试验效价。

（二）交叉保护试验

先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实

验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太

长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V；

应用已知免疫血清鉴定未知V；应用己知V鉴定天知血清。

（三）终点法中和试验

1、固定病毒一稀释血清法

将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCI%、EID.5O

或LDQ混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏

感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发

生病毒感染的能力及其效价。

以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血

清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PDG。

2、固定血清一一稀释病毒法

在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照

组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCIDQEID5。或LD.然后计算中

和指数。

五、材料

1、长满单层的细胞1瓶

2、胰酶、吸球、吸管、生长液

3、96孔细胞培养板

4、加样器、枪头

5、病毒液（PRV）

6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清

六、操作步骤

1、固定病毒一稀释血清法

1）测定病毒液的TCI丑

2）将测好TCIDs。的病毒液稀释成200个TCID$。的病毒悬液。

3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30nlin）作连续倍比稀释（具体

方法是在96孔板中先加入50山生长液，再加50M待检血清，混匀后，吸

50月至下一孔,如此下去。一直到1：256）,每个稀释度作4孔。

4）在上述各孔内加入50回稀释好的病毒液，混匀后放入37c5%C（）2培养箱中

作用45inin-60min＜）

5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，

其中病毒对照要作200个TCIDQ20个TCID“、2个TC%0.2个TCIDS04

个不同浓度的对照。

6）感作完成后每孔加入100N1细胞悬液，放37℃5%C02培养箱培养，逐日观察

并记录结果，一般要观察5-7天。

7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。

累计

血清稀释度CPE孔数无CPE孔数■保护率%

CPE孔数无CPE孔数

1：2(10.3)04015100(15/15)

1：4(IOm)04011100(11/11)

1:8(1O0-9)131787.5(7/8)

1：16(1012)132466.7(4/6)

1：32(101,5)315116.7(1/6)

1：64(10,8)40900(0/9)

1：128(10-21)401300(0/13)

1：256(10*)401700(0/17)

lgPD5（）=高下50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例X稀释度对数的差

=1.2+0.33X（-0.3）

=-1.299

距离比例二（高于50%的保护率-50%）/（高于50%的保护率一低于50%的保护率）

=（66.7-50）/（66.7-16.7）

=0.33

PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20

即1：20稀释的待检血清可保护50新勺组织培养细胞免于出现CPE。

2、固定血清一一稀释病毒法

1）将病毒作连续10倍稀释

2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50U1,

做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50ul待检血清（试验组），另一

块板子的每孔加入50u1正常血清（对照组），混合后置37℃5%C0z培养箱

作用Iho

3）然后在每孔中加入100111细胞悬液.

4）设两纵排正常细胞对照。

5）置37℃5%C0z培养箱培养，逐日观察并记录结果。

6）分别计算每组病毒的TCIDso,然后计算血清的中和指数。

中和指数二试验组TCID.5。/对照组TCID.5。

如：中和指数二10'7I（）7.O=]03'io00

判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于

10为阴性。

首先要纠正一下错误的问题描述。正确的换算公式是

1TCID50=0.7PFU

你的病毒滴度为：1072.3TCID50/0.1ml=10A13.3TCID50/ml

（你好像没有理解TCID50的概念，请参考这里：/bbs/topic/14324310）

10人13.3TCID50/ml=10A13.3TCID50/mlX1又因为1=0.7PFU/TC1D50,

所以10A13.3TCID50/ml=10八13.3TCID50/ml*0.7PFU/TCID50=

10A13.15PFU/ml

/bbs/topic/22833577

空斑分析（plaqueassay）是检测病毒感染颗粒滴度的一种常用方法。感染性滴度的单位一般表示

为PFU/ml,其中PFU（plaqueformingunit）表示空斑形成单位。它的优势在于可以直接用肉眼

看到一个一个空斑（一些杆信肉眼观察胜于可重复性的科学家非常乐意使用这个方法），但是它

的重复性比较差（有时候是非常差），因此笔者强烈推荐采用TQD50方法来计算病毒的感染单

位。

由于PFU又使用非常广泛，所以就涉及到PFU和TQD50换算的问题。简单地说他们的关系是：1

个TQD50约等于0.7个PFU,即：

1TCID50-0.7PFU

例如某病毒的滴度为105TCJD50/ml,那么它换算成PFU为：

105TCID50/ml=105TCID50/ml*1=105TCID50/ml*（0.7PFU/TCID50）=7*104PFU/ml

如果你是只求知其然那种科学家，知道这一点就够了，没有必要往下看了，但是千万别记反了。如果

你还想知其所以然，请继续看我的推演。我尽量做到深入浅出。

我们知道1个PFU在理想的情况下代表一个病毒颗粒，但是实验过程中会出现两个（或多个）病毒

颗粒粘在一起了，或者是它们感染了同一个细胞或两个非常相近的细胞，在形态上，只表现出一个空

斑，所以在严谨意义上又不好说一个空斑就是一个病毒，只好换了个说法：将形成一个空斑的病毒颗

粒的数量定义成空斑形成单位即PFUo事实上，1个PFU近似等于一个病毒颗粒。为了说明方便，

在下文中我有时候也把一个PFU就说成个病毒（当然是有感染性的病毒颗粒）o

根据TCID50的定义我们知道：用含有一个TCID50的病毒液体去感染细胞，有50%的感染可能性。

有的战友会说，那不就是：一个TQD50的病毒液体就是含有0.5个病毒了吗？又因为一个PFU约

等于1个病毒，所以1个TCID50约等于0.5PFU了吗？如果你理解到这•步，那恭喜你，你肯定不

会把TCID50/PFU的换算公式记反了，但是这个理解和实际情况是有偏差的。

回想一下，在TQD50试验结果中，我们只考察又多少个孔感染病毒，至于感染病毒的孔到底感染了

多少个病毒形成了多少个空斑，并没有在计算结果中反应出来。换句话说一个感染了病毒的孔，它可

能形成一个空斑，也可能形成两个、三个等多个空斑。所以说一个TCID50含有的病毒的数量要比

0.5个病毒多一点点，所以就有1个TCID50要略大于0.5PFU。那么到底大多少呢？别急，先恭喜

你下，你的理解有进了大步！

在进•步讲解这个0.7的近似值是如何计算出来之前，让我们来先回顾•下相关的数学概念。

现在我设想有一个摇奖机：机器里面有20个大小完全相同的球，卷次摇奖它可以掉出一定数量的球,

那么它掉出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？学过高中数学我们就可以知道掉出

n个球的概率符合二项分布。如果忘记了，你可以复习•下，如果不想复习，也不妨碍继续看我的帖

子。我简单说明•下，掉出1个和20个概率最小，渐渐地到掉出10个和11个的概率最大。二项分

布的概率函数图如下：

X

一；•

现在我们设想另外一种情况：如果是一个装有20个球的捞奖桶，然后用一个一定大小的勺子去捞出

一定数量的球，那么它捞出1个，2个，3个，……，20个球的概率分别是多少？如果我让你猜一猜

捞出几个球的概率最大，聪明的你肯定可以想到那取决与我给你的勺子有多大，如果勺子适合捞出

2.7个球，那么捞到3个球的概率最大。可以想象的是捞到20个球的概率几乎为0。同时我们知道

捞出的最大概率的球数实际上还取决于勺子的大小这个参数。关于这个数学模型，现在我们来学习•

下泊松分布

在二项分布的随机试验中，如果试验次数k很大，二项分布的概率p很小，旦乘积x=k*p比较适

中，则事件出现的次数的概率可以用泊松分布来逼近。具体的数学证明请看相关专业参考1%泊松分

布的概率函数图如下：

0.40

0.35

0.30

W

H0.25

X

)

d0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

05101520

kDZ/.CJJ

citedfrom:维基百科：泊松分布）

泊松分布的函数为：

P（X=k）=e-x*Ak/k!

其中x表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间（或单位面积）内随机事件的平均发生

频率。

在温故了二项分布并知新了泊松分布之后，我们再回过头来看看我们要解决的生物问题。在TQD50

试验中，一个孔形成非常非常多的空斑（即k很大）的情况的概率非常非常小（即接近0）,这种情况

可以用泊松分布来逼近。

解决生物问题的第一步是要把生物问题转化为数学问题。这一步是相当困难的！以下是TQD5C实验

结果转化为数学的描述：

根据TQD50的实验我们知道用一个TQD50的病毒液体去感染细胞，有一半会感染，而另一半不会

感染，换个说法就是：有一芈的孔会出现至少一个空斑，而另一半的孔则出现0个空斑（即不感染〉，

那么出现0个空斑的概率为0.5

即：

P（X=O）=e'*xo/O!=0.5

我们知道0!=L入°=1所以：

ex*l/l=0.5

求得

x=-ln（0.5）比0.69

终于看到了这个近似值是怎么来的了，可是这个X又表示什么意思呢？

泊松分布的函数为：

P（X=k）=e-x*Xk/ki

其中人表示一个正的实数，是一个数学期望值，表示是单位时间（或单位面积）内随机事件的平均发生

频率。

这个描述比较抽象，我在网上找到了另外一个比较好的解释（请参考这里：

/Poisson_Exp.php)

ThePoissonparameterLambda(')isthetotalnumberofevents(k)dividedbythe

numberofunits(n)inthedata(x=k/n).Theunitformsthebasisordenominator

forcalculationoftheaverage,andneednotbeindividualcasesorresearch

subjects.

Forexamples,ifwehave100people,andonly90ofthemgoshoppinginaweek

thenthebinomialriskofshoppingis90/100=0.9.However;someofthepeople

willgoshoppingmorethanonceintheweek,andthetotalnumberofshopping

tripsbetweenthe100peoplemaybe160,andthePoissonLambdais160/100=

1.6per100personweek.

关于x的解释还是很抽象，但是他给了一个很好的例子。把例子翻译过来就是：

在100个人中，只有90人每周去购物，那么单个人每星期去购物的机会为90/100=0.9。然

而一些人一个星期内不止去购物一次，而所有人的购物次数总和为160次。那么泊松分布的

\是160/100=L6次/A/星期。

如果再要求解•个人•周去购物两次的概率，就可以把入=1.6套入公式计算得到了。

好！现在我们来类比一下：现有100孔细胞，每孔接入0.1ml病毒液，只有50孔会感染病毒方产生

空斑，所以每孔细胞感染病毒的机会为0.5(这是根据TQD50的定义来的)。然而一些感染病毒的

孔可能不止形成•个空斑，所以这100个孔总共形成的空斑数目肯定＞50,假设它的数值为k,那么

X=k/100个空斑/每孔。

已经求得入=-ln(0.5),所以

-ln(0.5)=k/100

k=-ln(0.5)*100-70

即100个TCID50在理想状态下共可以形成-ln(0.5)*100)(^70)个空斑。

所以1个TCID50可以在理想状态下可以形成-ln(0.5)个空斑,即：

1TCID50=-ln(0.5)PFU-0.7PFU

更多讨论请参考我在丁香园发表的相关帖子：

/bbs/topic/14324310

/bbs/topic/22833577

MOI不是病毒的滴度，以下来自链接所给网站：MOI是multiplicityofinfection的缩写,

中文译为感染复数。一般认为M0I是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu

number/cell.后来M01被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数

量的比值。然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使M0I产生了不同的含

义。A，能产生细胞裂解效应的病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒

数量，因此其M0I的含义与传统的概念相同。B，对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu

表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒(viralparticles,v.p)或基因组数量(vector

genomexg.)来表示病毒数量。采用TU或IU,M0I的含义便是TUnumber/cell或IU

number/cello采用v.p.,MOI的含义便是v.p.number/cell。采用v.g,MOI的含义

便是vgnumber/cell。可以将上述不同的MOI表示方式分为2种：1)以活性单位表

示病毒数量,如pfu,TU,IUO这时MOI的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。

2)以病毒颗粒或基因组数表示病毒数量，如v.p.或v.g.。这时M0I的含义是指平均每

个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因组数。值得一提的是，上述2种不同的M0I表示方式

在含义和数值上都有所不同。前一种是传统意义上的MOI,后一种MOI表示方式的含义更

为简化和直观，也逐步被一些研究者采用。MOI的测定：其原理是基于病毒感染细胞是一

种随机事件，遵循Poisson分布规律，可计算出感染一定比例的培养细胞所需的感染复数

(MOI)o其公式为：P=1-P(0),P(0)=e-m或^1=-InP(0)o其中：P为被感

染细胞的百分率P(0)为未被感染细胞的百分率m为MOI值例如，如果要感染培养皿中

99%的培养细胞,则：P(0)=1%=0.01m=-In(0.01)=4.6pfu/celL由此可以看出，

由于病毒特性和研究者习惯的不同，M0I的单位由原来约定俗成的pfunumber/cell变成

多种表示单位。在阅读文献和写作论文时，应注意M0I的具体含义和单位。

中和试验

动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，

因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。中和试

险（NeutralizationTest是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存

感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。

中和试脸常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一

种是固定血清用量与等量系列对数稀释（即十信递次稀释）的病毒混合J然后把血清一病毒混

合物置适当的条件下感作一定时间后，接种于敏感细胞、鸡胚或动物，测定血清阻止病毒感

染宿主的能力及其效价。如果接种血清病毒混合物的宿主与对照（指仅接种病毒的宿主）一样

地出现病变或死亡，说明血清中没有相应的中和抗体。中和反应不仅能定性而且能定量，故

中和试蛉可应用于：

1-病毒株的种型鉴定：中和试睑具有较高的特异性，利用同一病毒的不同型的毒

株或不同型标准血清，即可测知相应血清或病毒的型，所以，中和试脸不但可以定属而

且可以定型。

2.测定血清抗体效价：中和抗体出现于病毒感染的校早期，在体内的维持时间较

W长。动物体内中O和抗体水平Q的高低，可o显示动物c抵抗病s毒的能.力。com

毒素和抗毒素亦可进行中和试脸，其方法与病毒中和试蛉基本相同。用组织细胞进行中

和试睑，有常量法和微量法两种，闵微量法简便，结果易于尹住，适于作大批量试睑，所以

近来得到了广泛的应用。

（-）定血清一稀羟病毒法（病毒中和试验）

1.病毒毒价的测定

毒价单位：衡量病毒毒价（毒力）的单位过去多用最小致死量QfLD）,即经规定的途径，以不

同的剂量接种试脸动物，在一定时间内能致全组试脸动物死亡的最小剂量。但由于剂量的递

增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂蚤的递增越不敬感。而一般在

死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量（LD50淮为毒价测定

单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试蛉动物，在一定时间内能致半数试睑动物死亡

的剂量C用.鸡胚测定时，害价单位为鸡胚半数致死量（FLD招威鸡胚半数感举蚩（FTD50）.

用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量（TCID50）。在测定疫苗的免疫性能时，则用半数

免疫量（IMD50）或半数保尹量（PD50）。

1）LD50的测定（以流行性乙型脑炎病毒为例）。

测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨,

配制成10-1悬液,300Crmin离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10“、10”、

IO-3……IO"5,每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml,逐日观察记录各组的

死亡数。

2）EID50的测定（以新城疫病毒为例》

将新鲜病毒液体10倍递次辎释法释成10-1、10-2、10-3……10-9不同稀释度，分别接种9-10

日龄鸡胚尿矗腔，鸡胚必须来自健康母鸡，并且没有新城疫抗体。每只鸡胚接种02ml,每

个稀释度接种6只鸡胚为一组，以石蜡封口，置37-38七培养，每天照蛋，24h之内死亡的

鸡胚弃掉，24h之后死亡的鸡胚置4七保存。连续培养5天，取尿曩液作血球凝集试睑，出

现血凝者判阳性，记录结果，按上述方法计算EID50。

3）TCID50的测定（以致细胞病变病毒为例）

取新鲜病毒悬液，以10倍逐次稀释成不同稀释度，每个稀释度分别接种经Hanks液洗3次

的组织细胞管，每管细胞接种0.2ml,每个稀释度接种1只细胞管，接种病毒后的细胞管放

在细胞盘内，细胞层一侧在下，使病毒与细胞充分接触，放置3忍吸附lh,加入维持海，

用37七培养，逐日观察并记录细胞病毒管数，按上述方法计算TCID50。

2.中和试验

L病毒稀羟度的选择

选择病毒稀释度范围，要根据毒价测定的结果而定，如寤毒的毒价为10f,贝J试蛉组选用

10-2-10-8对照组选用1）-4-10-8其原则是：最高稀释度要求动物全存活（或无细胞病

变），最低稀释度动物全死亡（或均出现细胞病变）。

2）血清处理

用于试蛤的所有血清在用前须作56七30mm加温灭活。但来自不同动物的血清，灭活的温

度和时间也是不同的。

3病毒的稀释

按选定的病毒稀释度范围，将病毒液作10倍递次稀释，使之成为所需要的稀释度。

4）感作

将不同稀释度病毒分别定蚩加入两排无菌试管内，第一排每管加入与病毒等量的免疫（或

被检）血清作为试蛉组；第二排每管加入与免疫（或被检）血清同种的正常阴性血清作为

对照组J充分摇匀后放37七感作12h。

5）接种

按“病毒价测定”中所述接种方法接种试睑动物（或鸡胚、组织细胞）。观察持续时间，根

据病毒和接种途径而定。

6）中和指数据计算

物按Reed和Muench两大法（或Karber）法分别计算试睑组和对照组的LD50（或EID50、

TCID50）

中和指数=试途及LD50（EID50、TCID50）

对照组LD50（EID50、TCID50）

假如试脸组LD50为10-22,对照组LD50为10-5.6。则中和指数为103.3,103.3=1995,

也就是说该待检血清卬和病毒的能力比正常血清大1995倍

7）结果判定

固定血清一稀滁病毒法过行中和试蛉，当中和指数大于50,表示辛阳血清中有中和抗体;

中和指数在10-50为可疑；若中和指数小于10为无中和抗体存在。

U）固定病毒-稀辞血清法（血清中和试蛉）

1.病毒毒价的测定（微量法）

1）病毒的制备

将病毒接种于单层细胞，37七吸附lh后加入维持'液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病

变（CPE）达75%以上，收获病毒悬'液冻融或超声波处理，以3000rmin寓心lOmin,取

上清海，定量分装成1ml小瓶置-70也保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致

病力。

2）病毒毒价测定

取贵・70七冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10/，10.2,

10-11……，每孔病毒悬液量为50山，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬满，每块

板的最后一行设S孔细胞方照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。把

培养板置5%CO2温箱37七培养，从48-14h逐日观察细胞病变：记录结果。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。

距离比例=5殍°-50“。

56%-33%

表2-25TCID50计算（接种剂量50囚）

病毒稀释度io-：IO-3io-510心10•-108io-9

接种数S888SSSS

CPE数SS754420

无CPE数O■013446S

累涓*CPE3t31231510620

无CPE00148121826

CPE率393931/3123/2415/1910/1S6/1S2200/26

百分数（%）10C10096795633100

IgTCID50=-6+0.26x（-1）=-6.3

则TCIDSglOEMB,50即病毒作10E63稀释，每孔接种50w，可使半数组织细胞管发生

病变。

2.中木瓶蛉

1）血清的处理

动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中不嗝毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗

补体抗体等。为排除这些不耐热的非特异性反应因素，用于中和试验的血清须经加热灭活

处理。各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、狼、猫及小鼠血清为60七;

水牛、狗及地鼠血清为62七；马兔血清为65七；人和豚鼠血清为56七。加熟时间为

20-30mm,60七以上加熟时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

2）稀释血清

取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀整涌作一系列倍比稀释，使其稀

释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64,每孔含分为50可，每个稀释度作

4孔。

3）病毒

取一70七冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCIT50稀释（与等量血清混合，其

毒价为100TCID50）o如本例病毒价为10-6.3,50山。所以应将病毒作2