《现代农业生物技术》课件-12-园艺植物遗传标记

第八章分子标记技术Chapter8

Molecularmarkertechnology主要内容分子标记概述常用的分子标记原理及实验技术分子标记的应用001002003第一节分子标记概述一、遗传标记的概念是指与目标性状紧密连锁、同该性状共分离且可遗传的等位基因变异。应具备多态性、共显性、稳定性和易观察性等特点。Allelicvariationthatiscloselylinkedto,co-isolatedfromandheritablewiththetargettrait.Itshouldbecharacterizedbypolymorphism,codominance,stabilityandeasyobservation.遗传标记Geneticmarker遗传标记的简介分子标记？？？？细胞学标记染色体（核型和带型）生化标记蛋白质分子（如等位酶、同工酶和储藏蛋白等）形态学标记株高、叶形、果实颜色、抗病抗虫性等二、分子标记的概念Geneticmarkerscharacterizedprimarilybypolymorphismsofthegeneticmaterialofanorganism,deoxyribonucleicacid(DNA),anditsexpressionproducts.广义：以生物体的遗传物质脱氧核糖核酸及其表达产物的多态性为主要特征的遗传标记。分子标记Molecularmarkers二、分子标记UsingmodernmolecularbiologytechnologytoanalyzeDNAmolecularcharacteristics,andwiththehelpofsomestatisticaltools,todistinguishdifferentspeciesordifferentgroups(individuals)ofthesamespecies,ortoestablishcorrelationbetweencertaintraitsoforganismsandDNAmolecularcharacteristics.——概念狭义：利用现代分子生物学技术分析DNA分子特性，并借助一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群（个体）区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起关联关系。分子标记Molecularmarkers分子标记的简介特点遗传特点、检测效率、技术要求、可靠性和成本种类以Southern杂交技术为核心：RFLP以PCR技术为核心：SSR、RAPD、EST、AFLP以电泳技术为核心：SSCP以基因芯片为核心：SNP碱基互换DNA片段形成连续重复序列DNA片段倒置DNA片段缺失或插入单个碱基缺失或插入三、分子标记的遗传基础分子标记的遗传基础分子标记的遗传基础分子标记的遗传基础分子标记的遗传基础优点不受植物组织类型、发育时期和环境条件等的影响；数量极多，可遍及整个基因组；多态性高；有许多标记为共显性，能够鉴别纯合或杂合基因型；有效区分不同物种之间的同源性和相似性；不影响目标形状的表达。缺点显性标记问题；基因型限制问题；标记的稳定性和可操作性问题。四、分子标记的优缺点第二节常用的分子标记原理及实验技术常用分子标记原理及实验技术RFLPRestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPDRandomAmplifiedPolymorphicDNASSRSimpleSequenceRepeatAFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphismSNPSingleNucleotide

Polymophism一、RFLP标记的概念Itisamolecularlabelingtechniquethatusesradioactiveisotopes(usuallyP32)ornon-radioactivesubstances(suchasdigoxin)tolabelprobesandSouthemhybridizationoftotalDNAtransferredtothesupportingmembrane,whichhasbeendigestedbyrestrictionenzymesinadvance,todetectthegeneticvariationofallelesbyshowingthelengthofrestrictionenzymecutfragments.——概念是利用放射性同位素(一般用P32)或非放射性物质(如地高辛)标记探针，与转移于支持膜上事先经限制性内切酶消化的总DNA杂交(Southem杂交)，通过显示限制性酶切片段的长短来检测等位位点的遗传变异一种分子标记技术。RFLP标记RFLPMarker一、RFLP标记优点核基因组RFLP表现为共显性遗传，而细胞质基因组RFLP为母性遗传；大多数RFLP表现为单位点上的双等位基因变异，且在等位之间表现为共显性，不受杂交方式的影响；在非等位的RFLP标记之间不存在上位互作效应；通过多种限制性内切酶组合使标记覆盖整个基因组；结果稳定可靠，重复性好，假阳性低。缺点该标记通常使用放射性同位素，存在安全隐患；为了获得好的酶切和杂交效果，对样品DNA质量和数量均有很高的要求；由于编码基因具有相当高的保守性，RFLP多态性变异程度偏低；需要制备探针，研究基础要求高。RFLP标记的特点RFLP标记的操作及影响因素影响因素RFLP对DNA质量和数量的要求；DNA酶切消化；电泳分离；Southern杂交。技术流程DNA提取→用限制性内切酶酶切DNA→用凝胶电泳分开DNA片段→把DNA片段转移到滤膜上→利用放射性标记的探针杂交显示特定的DNA片段（Southern杂交）和结果分析。二、RAPD标记的概念BytakingadvantageofthelargenumberofshortrepeatsinthetwostrandsofgenomicDNAmoleculesandusingtherandomlyarranged10-meroligonucleotidesinglestrandasprimer,PCRselectivelyamplifiesthespacingregionscomplementarytogenomicDNAandprimers.TheDNAmoleculardifferencesbetweenbiologicalspeciesorindividualscausedbymutationsofprimerbindingsitesandinsertionordeletionofspacerregionsareshown.——概念利用基因组DNA分子的两条链中存在大量的短的重复序列的特点以随机排列的10聚体寡核苷酸单链作为引物，通过PCR选择性扩增基因组DNA与引物互补的间隔区域，将各生物物种或个体之间由于引物结合位点突变及其间隔区域插入或缺失等变异所导致的DNA分子差异显示出来。RFLP标记RAPDMarker二、RAPD标记优点：对模板DNA质量和数量要求均较低；无需设计引物；操作简便、周期短，成本低；RAPD产物经克隆和序列分析后，可作为RFLP标记的探针，也转变为STS、SCAR等分子标记。缺点：RAPD标记为显性标记，不能区分杂合还是纯合，无法提供完整的遗传信息；由于引物碱基序列短、随机结合性强，退火温度低，结果容易受到试验条件影响，重复性较差。RAPD的技术特点RAPD的基本操作及影响因素（3）注意事项

引物在不同种群的差异性

引物在不同品种的差异性（2）影响因素PCR仪和程序设置PCR反应体系（1）基本操作

基因组DNA抽提-PCR-电泳-条带统计(）SimpleSequenceRepeat,alsoknownasmicrosatelliteDNA,isaclassoftandemrepeatDNAsequencesconsistingof1~6nucleotidesasrepeatingunits.概念三、SSR(简单序列重复)的概念又叫微卫星DNA，是一类由1～6个核苷酸为重复单位所组成的串联重复DNA序列。简单序列重复SimpleSequenceRepeat高度重复序列中度重复序列简单重复序列三、SSR(简单序列重复)的概念三、SSR(简单序列重复)微卫星位点分布于真核生物的整个基因组的不同位置上，不同物种或品种之间重复序列的个数是存在差异的，但是其两端的序列多是保守的单拷贝序列，因此，根据与微卫星重复序列两翼的特定序列设计引物，利用PCR技术进行扩增，用聚丙烯酰胺凝胶电泳可检测出重复数量的差异用来区分物种之间的差异。三、SSR——基本原理三、SSR——基本原理简单重复序列3.SSR的基本操作SSR引物获得SSR引物的开发A:cDNA文库构建、测序、设计。

B:基于EST序列、转录组或基因组数据设计使用近缘种的引物微卫星位点可能在属内、种内甚至在科内属间是保守的。数据库或有关文章中查询从GenBank中以FASTA格式下载葡萄EST序列从GenBank中以FASTA格式下载葡萄EST序列用CD-HIT在线软件去冗余SSRServer在线搜索SSRs引物的筛选葡萄EST-SSR引物获得的实例：用CD-HIT在线软件去冗余用CD-HIT在线软件去冗余用CD-HIT在线软件去冗余SSRServer在线搜索SSRsSSRServer在线搜索SSRs葡萄EST-SSRs中的基元种类及比例葡萄EST-SSRs中的单核苷酸种类及比例葡萄EST-SSRs中的二核苷酸种类及比例葡萄EST-SSRs中的三核苷酸种类及比例引物设计的原则（4）引物不应有发夹结构。即不能有4bp以上的回文序列（2）引物与靶序列间的Tm值不应过低，一般为55℃（1）引物长度大于16bp，一般为20-24个核苷酸，最佳为22个核苷酸（3）引物碱基尽可能随机分布(G+C约50%)葡萄引物引物编号PrimerNo.引物序列（5′→3′）Primersequence重复单元RepeatmotifGC%预期产物大小/bpExceptedproductsizeZ6M1F：GCTATCTGCATCATCTCCTGCT(ccctga)847253R：TGTCGTCTTCAGTTGGGTATGGZ6M2F：CCCATGGTCCCCACATTAAGAA(cccatt)647277R：GTCGATGAAGGTGCCGGTATATZ6M3F：CGAAAGCTCCTTCAACAGGTTG(aaaaag)447198R：AACAAGGACGCTTTGACCAATGZ6M4F：AAACCCATCTCCATCACCACTC(agcagt)447194R：CTGGCACCATCATCTCAACTCTZ5M5F：CATGTACGTGAGGAGGAGCTAC(gagga)652243R：AAGGGAACTCACCACAAAACCTZ5M6F：TTACTATTTCCGAGCCTGAGCC(tattt)544248R：CCTGGCAGTTTCTCCTTGATCTZ5M7F：GTTATCATCACAGCCACAACGG(atatg)446175R：TACTCGGTGAGTTTCTGCAGACZ4M8F：TGGAAAGGGATAGGTGAAAGCC（tttc）843179R：ATGCTTGGTATTTGGCAACCACZ4M9F：CCTCCAGTTCCATAAGGCTTGT（tcct）647192R：GGAAGGAAGGAAGGAAGGAAGGZ4M10F：ACGAAGCAGTGTAACCACATCTR：TTCAATTGGATGCCTTGCACTG（ggca）447218基因组DNA的提取CTAB法、SDS法、试剂盒法PCR扩增2.5%琼脂糖凝胶电泳6%聚丙烯酰胺凝胶电泳数据统计聚类分析优点：共显性标记多态性频率极高，结果重复性很高对DNA质量和数量要求低微卫星位点具有保守性操作简便缺点：需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息需要特异性引物（4）SSR的特点（4）SSR的特点四、AFLP标记（扩增片段长度多态性）基于对植物基因组DNA双酶切，再经过PCR扩增后选择限制性片段。在AFLP研究时，由于不同物种的基因组大小和组成不同，内切酶消化后产生具有粘性末端的、分子量大小不同的限制性片段，用含有与粘性末端互补的人工接头（Adapter）进行连接（Ligation），根据粘末端顺序和接头顺序设计引物，并在3’端添加了1-3个选择性碱基，进行选择性PCR扩增，PCR反应产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后加以分离和显带。——概念BasedondoubleenzymedigestionofplantgenomicDNA,restrictionfragmentswereselectedafterPCRamplification.InthestudyofAFLP,duetothedifferentgenomesizesandcompositionsofdifferentspecies,endonucleasedigestionproducedrestrictionfragmentswithstickyendsanddifferentmolecularweightsizes.Ligations(Ligation)wereobtainedbyartificialAdapter(Adapter)containingcomplementarystickyends.Primersweredesignedaccordingtothestickyendorderandjointorder.Inaddition,1-3selectivebaseswereaddedtothe3'endforselectivePCRamplification.ThePCRreactionproductswereseparatedandbandedbydenaturedpolyacrylamidegelelectrophoresis.AFLPmarker（AmplifiedFragmentLengthPolymorphism）优点标记数量多、多态性和检测效率高；选择中性、引物通用性好；结果可靠性高、重复性好。缺点操作过程比较复杂；对DNA对质量要求很高；采用同位素标记和非同位素（银染）标记。四、AFLP——技术特点AFLP的基本操作和影响因素高质量DNA模板制备酶切和接头连接选择性扩增酶切片段预扩增凝胶电泳分析五、SNP标记（单核苷酸多态性）的概念未引起蛋白质氨基酸序列改变的同义编码cSNP(synonymouscSNP，s-cSNP)；引起蛋白质编码氨基酸序列改变的非同义编码cSNP(nonsyno-nymouscSNP，ns-cSNP)。基因编码区的SNP称为编码SNP(codingSNP，cSNP)：单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，包括单个碱基的转换A→C、T→G、G→C和A→TSNP标记（单核苷酸多态性）SNPmarker(SingleNucleotidePolymorphism

优点数量多、分布广泛遗传稳定性高，遗传分析重现性好高通量、易于基因型分型缺点SNP图制作、基因分型和结果分析等方面还存在一些问题；除了基于公共数据库检索途径外，其它SNP方法研究费用比较昂贵；SNP标记的技术特点SNP标记的基本技术构建SNP数据库，即确定基因组SNP位点；解读SNP功能，即将SNP标记与性状特异性联系起来。非序列特异性的SNP检测序列特异性SNP检测基于公共数据库的直接搜索必须建立在较全面的SNP数据信息库基础之上。第三节分子标记的应用分子标记的应用遗传多样性分析亲缘关系和系谱分析种质资源鉴定遗传图谱的构建基因标记和定位分子辅助选择分子标记在园艺植物应用中存在的问题1

遗传多样性分析的概念遗传多样性分析Geneticdiversityanalysis遗传多样性是指地球上所有生物所携带的遗传信息的总和。但一般所指的遗传多样性是指种内的遗传多样性，即种内个体之间或一个群体内不同个体的遗传变异总和。研究意义对遗传多样性的研究可以揭示物种或居群的进化历史（起源的时间、地点、方式），也能为进一步分析其进化潜力和未来的命运提供重要的资料，尤其有助于物种稀有或濒危原因及过程的探讨。遗传多样性是保护生物学研究的核心之一，不了解种内遗传变异的大小时空分布及其与环境条件的关系，我们就无法采取科学有效的措施来保护人类赖以生存的遗传资源基因，来挽救濒于绝灭的物种。对遗传多样性的研究有助于人们更清楚地认识生物多样性的起源和进化，尤其能加深人们对微观进化的认识，为动植物的分类进化研究提供有益的资料，进而为动植物育种和遗传改良奠定基础。1

遗传多样性分析Geneticdiversityanalysis1

遗传多样性分析1

遗传多样性分析2亲缘关系和系谱分析Geneticrelationshipanalysis2亲缘关系和系谱分析2亲缘关系和系谱分析种质资源是指植物遗传物质，包括种子、种苗、细胞和组织等，具有重要的遗传和经济价值。在现代农业中，种质资源是培育高产、优质、抗逆品种的基础，是推动农业科技创新和现代化的重要资源。因此，对种质资源进行精准鉴定和评价，有助于发掘和利用种质资源的遗传多样性，提高品种选育的效率和成功率，促进农业的发展。Identificationofgermplasmresources3种质资源鉴定3种质资源鉴定葡萄(VitisL.)是葡萄科的多年生藤本植物，全世界至少有23000个品种。由于其无性繁殖能力强、适宜种植范围广、不同地区间葡萄品种交流频繁，而部分引种或地方品种又没有确切的科学名称，难免发生同物异名或同名异物现象。此外，目前葡萄苗市场管理不完善，品种名称随意变动、炒作品种等不良影响时有发生，极大地损害了育种者的利益。因此，经济、高效、准确的品种鉴定对于提高葡萄种质的管理效率和品种保护能力具有重要意义。葡萄品种SNP分子鉴定系统的建立与应用3种质资源鉴定材料方法4遗传图谱的构建遗传图谱又称连锁图谱、遗传连锁图谱。如果说物理图谱指的是碱基在DNA上的线性排列，那么遗传图谱则指基因或DNA分子标记在染色体上的排列顺序了，根据选定的基因或分子标记，以及这些标记之间的重组率为“图距”确定不同多态性标记位点在每条连锁群上排列的顺序和遗传距离所得到的图谱就称为遗传图谱。Constructionofgeneticmap4遗传图谱的构建5基因标记和定位果树的许多农艺性状，如产量、品质、抗病性和抗逆性等都是数量性状。与质量性状不同，数量性状一般受多基因控制，遗传基础复杂，易受环境影响，表现为连续变异，且表现型与基因型之间没有明确的对应关系（杨文利等，2003)，因此数量性状的遗传研究十分困难。传统的对数量性状的研究只能把多基因系统作为一个整体，检测其整体遗传效应和环境效应，却无法确定控制数量性状的QTL个数，更无法确定单个QTL在染色体上的位置和它们的效应。然而，分子标记技术的出现给数量遗传研冗市来一助革命，研究者开