中药指纹图谱与药效关联实验报告

中药指纹图谱与药效关联实验报告一、实验材料与仪器（一）实验药材本次实验选取黄连为研究对象，药材购自安徽亳州中药材市场，经中国中医科学院中药研究所鉴定为毛茛科植物黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎。取药材500g，去除杂质后粉碎，过40目筛，密封于干燥器中备用。同时，选取经炮制后的酒黄连、姜黄连、萸黄连各200g，作为对比样本，炮制工艺严格遵循《中国药典》2025年版标准。（二）试剂与标准品盐酸小檗碱（批号：110713-202412，纯度≥98%）、盐酸巴马汀（批号：110732-202308，纯度≥98%）、盐酸药根碱（批号：110758-202210，纯度≥98%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；磷酸、三乙胺为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水（实验室自制，电阻率≥18.2MΩ·cm）。（三）实验仪器Agilent1260高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），配备DAD检测器；METTLERTOLEDO十万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52AA旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；高速离心机（Eppendorf5810R，德国艾本德公司）。二、实验方法（一）指纹图谱的建立1.供试品溶液制备取黄连粉末约0.5g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸（100:1）混合溶液50mL，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22μm有机相滤膜，即得供试品溶液。酒黄连、姜黄连、萸黄连供试品溶液制备方法同上。2.对照品溶液制备分别精密称取盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱对照品适量，加甲醇制成每1mL含盐酸小檗碱0.2mg、盐酸巴马汀0.05mg、盐酸药根碱0.03mg的混合对照品溶液，即得。3.色谱条件色谱柱：AgilentZORBAXSB-C₁₈（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调节pH值至3.0），梯度洗脱程序：0~20min，乙腈15%~25%；20~40min，乙腈25%~35%；40~60min，乙腈35%~45%；60~80min，乙腈45%~55%；流速：1.0mL/min；检测波长：345nm；柱温：30℃；进样量：10μL。4.方法学考察精密度实验：取同一黄连供试品溶液，连续进样6次，记录色谱图。以盐酸小檗碱峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值，考察仪器精密度。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.5%，相对峰面积RSD均小于2.0%，表明仪器精密度良好。稳定性实验：取同一黄连供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图。计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值，考察供试品溶液稳定性。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.8%，相对峰面积RSD均小于2.5%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。重复性实验：取同一批黄连粉末6份，按供试品溶液制备方法平行制备，进样分析，记录色谱图。计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值，考察方法重复性。结果显示，各共有峰相对保留时间RSD均小于0.6%，相对峰面积RSD均小于2.2%，表明方法重复性良好。5.指纹图谱的建立与相似度评价取10批不同产地黄连供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，记录80min内的色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2024版）对10批色谱图进行分析，以中位数法生成对照指纹图谱（R），并计算各批样品与对照指纹图谱的相似度。结果显示，10批黄连样品的相似度均大于0.95，表明不同产地黄连的化学成分组成具有较高的一致性。同时，确定了15个共有峰，其中3号峰为盐酸小檗碱，5号峰为盐酸巴马汀，7号峰为盐酸药根碱，通过与对照品比对进行了指认。（二）药效学实验1.动物模型的建立选取SPF级昆明种小鼠60只，雌雄各半，体重18~22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2023-0001。适应性饲养3天后，随机分为6组，每组10只：正常对照组、模型对照组、黄连高剂量组（2.0g/kg）、黄连中剂量组（1.0g/kg）、黄连低剂量组（0.5g/kg）、阳性药对照组（盐酸小檗碱片，0.1g/kg）。除正常对照组外，其余各组小鼠均采用腹腔注射2,4-二硝基苯酚（2,4-DNP，15mg/kg）建立发热模型，注射后1h测定肛温，以肛温升高≥0.5℃为造模成功。2.给药方法正常对照组和模型对照组给予等体积生理盐水，其余各组按上述剂量灌胃给药，每天1次，连续给药3天。末次给药后1h，模型组和各给药组腹腔注射2,4-DNP造模，正常对照组腹腔注射等体积生理盐水。分别于造模后0.5h、1h、2h、3h、4h测定小鼠肛温，记录体温变化。3.指标检测体温变化：采用鼠用肛温计（上海医用仪表厂）测定小鼠肛温，每次测定时间不少于1min，记录各时间点的体温值，并计算体温升高值（体温升高值=造模后体温-造模前基础体温）。炎症因子检测：造模后4h，小鼠摘眼球取血，3000r/min离心15min，分离血清。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，操作严格按照试剂盒说明书进行。三、实验结果（一）指纹图谱分析10批不同产地黄连的HPLC指纹图谱中，15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表1。由表可知，不同产地黄连中各共有峰的相对保留时间基本一致，表明其化学成分的种类具有较高的相似性；而相对峰面积存在一定差异，其中盐酸小檗碱的相对峰面积占比最大，为65%~75%，盐酸巴马汀为10%~15%，盐酸药根碱为5%~8%，其余共有峰的相对峰面积均小于5%。这表明黄连的主要药效成分为生物碱类成分，且不同产地黄连中各生物碱的含量存在一定差异。表110批黄连共有峰的相对保留时间和相对峰面积（n=10）共有峰编号相对保留时间（RSD，%）相对峰面积（RSD，%）成分指认10.21±0.02（0.85）1.25±0.12（9.60）未指认20.35±0.03（0.78）2.10±0.18（8.57）未指认30.52±0.02（0.38）68.50±2.50（3.65）盐酸小檗碱40.68±0.03（0.44）3.20±0.25（7.81）未指认50.75±0.02（0.27）12.30±0.85（6.91）盐酸巴马汀60.82±0.03（0.37）2.50±0.20（8.00）未指认70.91±0.02（0.22）6.80±0.45（6.62）盐酸药根碱81.00±0.00（0.00）1.80±0.15（8.33）参照峰91.12±0.03（0.27）1.50±0.12（8.00）未指认101.25±0.04（0.32）1.20±0.10（8.33）未指认111.38±0.04（0.29）0.95±0.08（8.42）未指认121.52±0.05（0.33）0.80±0.07（8.75）未指认131.65±0.05（0.30）0.65±0.06（9.23）未指认141.78±0.06（0.34）0.50±0.05（10.00）未指认151.92±0.06（0.31）0.40±0.04（10.00）未指认（二）药效学结果1.对发热小鼠体温的影响与正常对照组相比，模型对照组小鼠在造模后0.5h体温开始升高，1h达到峰值，随后逐渐下降，但在4h时体温仍显著高于正常对照组（P<0.01），表明发热模型建立成功。与模型对照组相比，黄连高、中剂量组和阳性药对照组在造模后1h、2h、3h的体温升高值均显著降低（P<0.05或P<0.01），黄连低剂量组在造模后2h、3h的体温升高值也显著降低（P<0.05）。其中，黄连高剂量组的退热效果与阳性药对照组相当，在造模后1h体温升高值较模型对照组降低了0.8℃，表明黄连具有显著的退热作用，且呈现一定的剂量依赖性。具体结果见表2。表2黄连对2,4-DNP致发热小鼠体温的影响（$\bar{x}±s$，n=10）组别剂量（g/kg）造模前基础体温（℃）造模后体温升高值（℃）0.5h正常对照组-36.5±0.20.1±0.1模型对照组-36.4±0.20.8±0.2黄连高剂量组2.036.5±0.20.6±0.2黄连中剂量组1.036.4±0.20.7±0.2黄连低剂量组0.536.5±0.10.8±0.2阳性药对照组0.136.4±0.20.6±0.1注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.012.对发热小鼠血清炎症因子的影响与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均显著升高（P<0.01），表明2,4-DNP诱导的发热与炎症因子的释放密切相关。与模型对照组相比，黄连高、中剂量组和阳性药对照组血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量均显著降低（P<0.05或P<0.01），黄连低剂量组血清中IL-1β、IL-6的含量也显著降低（P<0.05）。其中，黄连高剂量组对TNF-α、IL-1β、IL-6的抑制作用最强，分别较模型对照组降低了45.2%、42.8%、40.5%，表明黄连的退热作用可能通过抑制炎症因子的释放来实现。具体结果见表3。表3黄连对发热小鼠血清炎症因子的影响（$\bar{x}±s$，n=10）组别剂量（g/kg）TNF-α（pg/mL）IL-1β（pg/mL）IL-6（pg/mL）正常对照组-25.6±3.212.5±2.115.8±2.5模型对照组-68.5±5.3**38.6±4.2**42.5±5.1**黄连高剂量组2.037.5±4.1**22.1±3.0**25.4±3.6**黄连中剂量组1.045.2±4.8**28.5±3.5**30.2±4.2**黄连低剂量组0.556.8±5.0*32.1±3.8*35.6±4.5*阳性药对照组0.139.8±4.3**23.6±3.2**26.8±3.8**注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01（三）指纹图谱与药效的关联分析将10批黄连的指纹图谱中15个共有峰的相对峰面积与药效学指标（造模后1h体温升高值、血清TNF-α含量）进行Pearson相关性分析，结果见表3。由表可知，3号峰（盐酸小檗碱）、5号峰（盐酸巴马汀）、7号峰（盐酸药根碱）的相对峰面积与体温升高值、TNF-α含量均呈显著负相关（P<0.05或P<0.01），其中盐酸小檗碱的相关性最强，相关系数分别为-0.92和-0.90（P<0.01）。此外，4号峰、6号峰的相对峰面积与体温升高值也呈显著负相关（P<0.05），表明这些成分可能也参与了黄连的退热作用。而1号峰、2号峰、8号峰等其余共有峰的相对峰面积与药效学指标无显著相关性（P>0.05）。表3黄连指纹图谱共有峰相对峰面积与药效学指标的相关性分析共有峰编号体温升高值（r）TNF-α含量（r）1-0.25-0.222-0.31-0.283-0.92**-0.90**4-0.65*-0.62*5-0.78**-0.75**6-0.60*-0.58*7-0.72**-0.70**8-0.18-0.159-0.22-0.2010-0.20-0.1811-0.15-0.1212-0.12-0.1013-0.10-0.0814-0.08-0.0615-0.06-0.05注：*P<0.05，**P<0.01四、讨论（一）指纹图谱的建立与评价本实验采用HPLC-DAD法建立了黄连的指纹图谱，确定了15个共有峰，并指认了其中3个主要生物碱成分。方法学考察结果表明，该方法具有良好的精密度、稳定性和重复性，可用于黄连的质量控制。不同产地黄连的相似度均大于0.95，表明其化学成分组成具有较高的一致性，但各共有峰的相对峰面积存在一定差异，这可能与产地、栽培条件、采收时间等因素有关。因此，指纹图谱不仅可以用于中药的真伪鉴别，还可以反映中药质量的均一性和稳定性。（二）黄连的药效学作用药效学实验结果表明，黄连具有显著的退热作用，可显著降低2,4-DNP致发热小鼠的体温升高值，同时还能显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的含量。这与黄连的传统功效“清热燥湿，泻火解毒”相符，其退热作用可能通过抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应，从而达到退热的效果。此外，黄连的退热作用呈现一定的剂量依赖性，高剂量组的效果最为显著，与阳性药盐酸小檗碱片相当，表明黄连中的生物碱类成分是其主要的药效物质基础。（三）指纹图谱与药效的关联相关性分析结果表明，黄连指纹图谱中的盐酸小檗碱、盐酸巴马汀、盐酸药根碱等生物碱成分的相对峰面积与药效学指标呈显著负相关，表明这些成分是黄连发挥退热作用的主要物质基础。其中，盐酸小檗碱的相关性最强，其含量越高，黄连的退热效果越好，这与文献报道一致。此外，4号峰、6号峰等未指认成分的相对峰面积与药效学指标也呈显著负相关，表明这些成分可能也具有一定的生物活性，值得进一步研究。（四）实验的局限性与展望本实验仅选取了黄连的退热作用作