ISO 6888-22021 食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第2部分兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基法标准立项发展报告

ISO6888-2:2021《食物链微生物学凝固酶阳性葡萄球菌（金黄色葡萄球菌和其他种类）计数的水平方法第2部分：兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基法》标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part2:Methodusingrabbitplasmafibrinogenagarmedium摘要食品安全是公共卫生领域的重要议题，而凝固酶阳性葡萄球菌（以金黄色葡萄球菌为代表）作为常见的食源性致病菌，其准确计数对于食品微生物风险评估和质量控制具有关键意义。ISO6888-2:2021是国际标准化组织（ISO）发布的关于食品及动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌计数的水平方法标准，具体规定了采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基（RPF培养基）进行菌落计数的技术规程。该标准于2021年8月16日发布，是ISO6888-2:1999的修订版本，替代原有技术内容并纳入最新的微生物学检测技术进展。本报告系统梳理了该标准的立项背景、技术内容、修订要点及应用价值，详细介绍了参与标准制修订的主要技术单位，并就该标准的未来发展方向进行了展望。该标准的实施为全球食品微生物检测实验室提供了统一、可靠的操作规范，对保障国际贸易中食品质量安全、促进检测结果互认具有重要的支撑作用。关键词：凝固酶阳性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌；兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基；水平方法；食品微生物学；国际标准；菌落计数Keywords:coagulase-positivestaphylococci;Staphylococcusaureus;rabbitplasmafibrinogenagarmedium;horizontalmethod;foodmicrobiology;internationalstandard;colonyenumeration一、引言1.1研究背景凝固酶阳性葡萄球菌（Coagulase-positivestaphylococci,CoPS）是食品微生物安全监测中的重要指示菌群，其中以金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）最为典型。该菌种能够产生多种毒力因子，包括肠毒素、凝固酶和耐热核酸酶等，其中肠毒素引起的食物中毒是常见的细菌性食源性疾病之一。根据世界卫生组织（WHO）的估计，全球每年约有6亿人因食用受污染的食品而患病，其中细菌性病原体是主要致病因素之一。金黄色葡萄球菌肠毒素食物中毒的典型症状包括恶心、呕吐、腹痛和腹泻，通常在摄入被污染食品后2-6小时内发作。在食品微生物检验领域，凝固酶阳性葡萄球菌的计数被广泛应用于肉类及肉制品、乳及乳制品、水产品、即食食品及餐饮食品等多种食品基质的安全性评价。各国食品安全标准中普遍设定了该菌群的限量指标，如食品中凝固酶阳性葡萄球菌的数量不得超过特定阈值（通常为10²-10⁴CFU/g不等，视食品类别而定），因此建立一个国际公认的、准确可靠的计数方法至关重要。1.2标准的国际地位与作用ISO6888系列标准是全球食品微生物检验领域采用最广泛的凝固酶阳性葡萄球菌计数方法标准之一。该系列标准分为三个部分：第1部分采用Baird-Parker琼脂培养基（基于卵黄亚碲酸盐甘氨酸丙酮酸琼脂），第2部分（即本报告所涉及的标准）采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基，第3部分则基于MPN（最可能数）技术。其中，ISO6888-2:2021所规定的RPF琼脂培养基法因其较高的特异性和简便的操作流程，在国际实验室中得到了广泛应用。本标准的适用性与国际食品微生物规范委员会（ICMSF）及食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission）的相关指南保持协调一致，是国际贸易中食品安全检测的重要技术依据。二、标准技术内容概述2.1标准基本信息|项目|内容||------|------||标准编号|ISO6888-2:2021||发布机构|国际标准化组织（ISO）||技术委员会|ISO/TC34/SC9（食品微生物学）||ICS分类号|07.100.30（食品微生物学）||发布日期|2021年8月16日||替代标准|ISO6888-2:1999||标准状态|现行有效||适用领域|食品链微生物学——水平方法|2.2技术原理ISO6888-2:2021规定了使用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基（RabbitPlasmaFibrinogenAgar,RPF）对食品和动物饲料中的凝固酶阳性葡萄球菌进行计数的水平方法。该方法的原理基于凝固酶阳性葡萄球菌能分泌凝固酶（coagulase）的生物学特性，凝固酶可使血浆中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而在菌落周围形成不透明的沉淀晕环（halo），以此作为鉴定和计数的依据。RPF培养基是在基础培养基中添加兔血浆和纤维蛋白原（fibrinogen）制成的选择性鉴别培养基。该培养基同时含有选择性抑制剂，能够有效抑制革兰氏阴性菌和大部分革兰氏阳性杂菌的生长，而凝固酶阳性葡萄球菌则能在该培养基上正常生长并产生典型的水解圈或沉淀圈反应。孵育后，具有凝固酶活性的菌落周围会出现不透明的白色沉淀晕，从而可直接进行计数，无需额外的确认试验步骤。2.3标准主要内容框架ISO6888-2:2021标准的主要技术内容涵盖以下章节：-范围（Scope）：适用于食品和动物饲料中凝固酶阳性葡萄球菌的计数，检测限一般为10CFU/g（mL）；-规范性引用文件：包括ISO6887系列（样品制备）、ISO7218（微生物检验一般要求）及ISO11133（培养基的制备与性能测试）等；-术语和定义：明确了凝固酶阳性葡萄球菌、选择性计数等核心概念；-原理：描述了RPF培养基上凝固酶阳性葡萄球菌的计数原理及反应机制；-稀释液与培养基：详细规定了稀释液配方、RPF培养基的组成成分、制备方法及质量控制要求；-仪器与耗材：列出了所需的微生物学实验室通用仪器设备；-操作步骤：从样品制备、十进制稀释、接种（表面涂布法）、培养条件（37℃±1℃，24-48小时）到菌落计数和结果计算的全流程操作规范；-结果表达：规定了结果的计算方式、单位表达及不确定度评估要求；-质量保证：包含培养基性能验证、阳性对照菌株的使用（如*S.aureus*ATCC®6538™等）以及实验室内部质量控制措施；-试验报告：对检测报告应包含的信息作了规定。2.4主要修订变化（相较于ISO6888-2:1999）ISO6888-2:2021在1999年版的基础上进行了以下重要修订：1.范围扩展：将适用范围从"食品和动物饲料"扩展为"食物链"，与ISO其他微生物学方法标准保持一致，便于覆盖从初级生产到消费的全链条；2.规范性引用文件更新：纳入最新版的ISO6887系列和ISO11133标准，确保方法的前后衔接性和一致性；3.培养基要求细化：对RPF培养基中关键组分（如兔血浆的来源、纤维蛋白原浓度等）的规格和质量要求进行了更明确规定；4.确认程序优化：修订了可疑菌落的确认规则，增加了对非典型菌落的处理指导；6.内容编辑性调整：根据ISO标准化文件中关于术语、图表格式的最新要求进行了编辑性修改，并与ISO6888-1:2021保持结构一致性。三、标准的应用价值与技术优势3.1技术优势分析与ISO6888-1所规定的Baird-Parker琼脂培养基法相比，ISO6888-2:2021所采用的RPF培养基法具有以下显著技术优势：1.特异性更高：RPF培养基对凝固酶阳性葡萄球菌具有更高的选择性，由于凝固酶反应直接作为鉴定指标，降低了因形态学判读产生的假阳性率；2.步骤简化：该方法无需进行传统方法中所需的凝固酶确认试验（如试管凝固酶试验），在RPF培养基上可直接依据菌落形态和沉淀晕进行计数，缩短了检测周期（从约4天缩短至2天以内）；3.人为误差减少：由于典型反应特征明确，不同操作人员之间的判读差异较小，方法的重复性和再现性良好；4.与分子生物学方法的衔接：该方法可以作为传统培养法与分子确认方法（如PCR检测*nuc*基因或*coa*基因）之间的有效桥梁。3.2实际应用场景该标准在全球食品微生物检测实验室中应用广泛，主要场景包括：-食品安全监督检验：各国家和地区食品安全监管机构实验室对市场上的肉类、乳制品、水产品等高风险食品进行例行监测；-进出口食品检验：国际贸易中食品进出口双方依据该标准进行符合性检测，确保贸易顺畅；-食品生产企业自检：食品生产企业内部质量控制实验室按照HACCP体系要求，对原料、半成品和成品进行微生物监测；-食源性疾病暴发调查：在食物中毒事件调查中对可疑食品进行病原学检测和定量分析；-风险评估研究：为定量微生物风险评估（QMRA）提供菌群计数数据支撑。四、主要制修订单位与技术支持机构4.1ISO/TC34/SC9食品微生物学技术委员会ISO6888-2:2021由国际标准化组织下设的ISO/TC34（食品产品技术委员会）/SC9（食品微生物学分会）负责制定和修订。ISO/TC34/SC9的秘书处由法国标准化协会（AFNOR）承担，委员会汇集了来自全球各成员体的微生物学专家、政府机构代表、科研机构和行业组织的技术力量。4.2主要技术支持单位：法国食品环境职业健康安全署（ANSES）在ISO6888-2:2021的修订过程中，法国食品环境职业健康安全署（Agencenationaledesécuritésanitairedel‘alimentation,del’environnementetdutravail,ANSES）担任了重要的技术支持角色。ANSES是法国国家级食品安全风险评估与参考实验室机构，其食品安全实验室（LaboratoiredelaSantédesVégétauxetdelaSécuritédesAliments）下设有多个国家参考实验室（NRL），其中食品微生物学参考实验室在凝固酶阳性葡萄球菌检测方法开发和标准化方面具有长期的研究积累和实践经验。该机构的主要技术贡献包括：-组织和协调国际实验室间比对试验（collaborativetrials），验证RPF培养基法的重复性和再现性-为培养基组分优化和性能指标确定提供实验数据支持-在标准修订讨论中提供关于凝固酶阳性葡萄球菌流行病学特征的最新科学证据此外，其他积极参与该标准制修订工作的机构还包括荷兰国家公共卫生与环境研究所（RIVM）、德国联邦风险评估研究所（BfR）、美国食品药品监督管理局（FDA）等机构的微生物学专家，以及国际乳品业联合会（IDF）等国际行业组织的技术代表。这些机构的共同参与保障了标准的科学性、公正性和全球适用性。五、结论与展望5.1总结ISO6888-2:2021作为国际食品微生物检验领域的重要方法标准，为全球范围内凝固酶阳性葡萄球菌的计数提供了统一且可靠的技术规范。该标准通过采用兔血浆纤维蛋白原琼脂培养基法，在保证检测特异性的同时有效简化了操作流程、缩短了检测周期，深度契合了现代食品微生物实验室对高通量、快速检测的需求。标准的核心价值体现在三个方面：一是作为国际贸易中食品安全检测的技术依据，促进了各国检测结果互认；二是为食品生产企业实施HACCP体系过程中的微生物验证提供了可行的定量检测方案；三是为政府部门开展食品安全风险监测和监督抽检提供了科学的方法学基础。5.2未来发展方向随着食品微生物学的持续发展，凝固酶阳性葡萄球菌检测技术也在不断演进。展望未来，该领域的发展可能呈现以下趋势：第一，快速检测技术的融合与验证。随着分子生物学技术的快速发展和数字化检测设备的推广，基于实时荧光定量PCR、等温扩增（LAMP）、生物传感器及微流控芯片等技术的快速检测方法不断涌现。如何在保持传统培养法结果可比性的前提下，将这些新兴技术纳入或补充到ISO标准体系中，将是未来标准修订的重要议题。ISO/TC34/SC9已开始关注检测替代方法与参考方法之间的等效性验证框架建设。第二，基因组学方法的应用。全基因组测序（WGS）技术在食源性致病菌监测中的应用日益普及，该技术不仅能实现菌种鉴定，还能提供毒力基因和耐药基因等深层信息。未来标准可能会增加与WGS技术相互衔接的采样和分离要求，为溯源调查和风险评估提供更丰富的数据支持。第三，基质适用性的进一步拓展。随着新型食品（如植物基肉制品、昆虫蛋白食品、细胞培养肉等）的出现和食品加工方式的创新，现有方法的基质适用范围可能需要进一步扩展和验证。标准制定者需持续关注食品工业发展的最新动向，确保标准的适用性和前瞻性。第四，实验室数字化转型与人工智能技术的引入。智能化菌落计数系统、实验室信息系统（LIMS）的普及以及人工智能图像识别技术在菌落判读中的应用，正在改变传统微生物检测的工作流程。未来标准可能需要增补自动化计数设备的性能要求和验证指南，以适应实验室数字化转型的趋势。第五，标准体系的协调一致。在全球食品安全标准一体化的背景下，ISO6888-2:2021与其他国际组织标准（如食品法典委员会相关标准、国际乳品业联合会标准）以及各区域性标准（如CEN欧洲标准）之间的协调一致性将持续加强，以减少国际贸易中的技术壁垒，促进全球食品安全治理体系的完善。综上所述，ISO6888-2:2021的发布与实施是食品微生物检测领域标准化工作的重要里程碑。在未来，随着科学技术的进步和食品安全管理需求的不断升级，该标准将持续得到评估和优化，为保障全球食品安全贡献更大的力量。参考文献[1]ISO6888-2:2021,Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part2:Methodusingrabbitplasmafibrinogenagarmedium[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2021.[2]ISO6888-1:2021,Microbiologyofthefoodchain—Horizontalmethodfortheenumerationofcoagulase-positivestaphylococci(Staphylococcusaureusandotherspecies)—Part1:MethodusingBaird-Parkeragarmedium[S].Geneva:InternationalOrganizationforStandardization,2021.[3]ISO7218:2007/Amd1:2013,Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs—Generalrequirementsandguidanceformicrobiologicalexaminations[S].Geneva:InternationalO