药品生物检定技术（第2版）课件 第7、8章 其他生物检查法、生物检定统计法

第七章其他生物检查法目录01抑菌效力检查02降压物质检查04组胺类物质检查03升压物质检查05过敏反应检测04溶血与凝聚检查学习目标1.掌握抑菌效力、降压物质、升压物质、组胺、过敏反应、溶血与凝集的概念及基本原理。2.熟悉各检查法对实验动物的要求、操作过程及结果判断。3.了解各检查法的注意事项。知识目标1.能规范完成实验动物的抓取、静脉注射等操作。2.能准确记录实验数据，识别实验问题，初步分析原因。3.能结合检查原理解释实际检测问题。能力目标1.树立严谨求实态度，养成合规操作习惯，确保数据真实。2.培养药品质量安全的责任意识。3.严格遵守动物实验室安全规定，秉持动物伦理理念。素养目标第一节抑菌效力检查法

抑菌剂是指抑制微生物生长的化学物质。抑菌剂可应用于多种类型的制剂，如口服液体制剂、眼部制剂、耳用制剂、鼻用制剂、栓剂、外用制剂、注射剂、吸入剂等。常用的抑菌剂种类包括苯甲酸及其钠盐、对羟基苯甲酸及其钠盐、对羟基苯甲酸酯、醇类防腐剂等。

基本概念抑菌效力检查系用于测定无菌及非无菌制剂的抑菌活性，用于指导生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂浓度的确定，而非日常产品放行的检查试验。尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。如果药物本身不具有充分的抗菌效力，应根据制剂特性添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中由于微生物污染和繁殖，尤其是多剂量包装的制剂。如果药物本身不具有充分的抗菌效力，应根据制剂特性添加适宜的抑菌剂，以防止制剂在正常贮藏或使用过程中由于微生物污染和繁殖，尤其是多剂量包装的制剂。但抑菌剂的使用不能替代药品生产过程中GMP管理，不能作为非无菌制剂降低微生物污染的唯一途径，也不能作为控制多剂量包装制剂灭菌前的生物负载的手段。所有抑菌剂都具有一定毒性，制剂中抑菌剂的量应为最低有效量。一、基本原理

本法利用试验菌在适宜培养基上的生长情况来判断制剂的抑菌活性。二、基本步骤（一）试验前准备培养基您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要菌种您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要设备您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要稀释液您的正文已经简明扼要，字字珠玑，但请您尽可能提炼思想的精髓，以减少观者的阅读压力。您的正文已经简明扼要生化培养箱，天平（精度0.1mg）等pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液。胰酪大豆胨液体培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌二、基本步骤（二）操作过程1.培养基的适用性检查菌液制备后若在室温下放置，应在2h内使用；若保存在2～8℃，可在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的新鲜培养物用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度菌悬液。黑曲霉新鲜培养物加入适量含0.05％（g/mL）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或含0.05％（g/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用上述稀释液制成适宜浓度的孢子悬液。（1）菌液制备（2）适用性检查

分别接种不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的菌液至胰酪胨大豆琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置30～35℃培养不超过3天，计数；分别接种不大于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝固，置20～25℃培养不超过5天，计数；同时，用对应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。（3）结果判定

被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上菌落平均数的比值应在0.5~2范围内，且菌落形态大小与对照培养基上的菌落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。2.供试品抑菌效力检查（1）菌液制备

菌种与培养基适用性检查一致，若需要，制剂中常见的污染微生物也可以作为试验菌株，如含高浓度糖的口服制剂还应选鲁氏酵母为试验菌。（2）供试品接种

取包装完整的供试品至少4份，直接接种试验菌，或取适量供试品分别转移至4个适宜的无菌容器中（若试验菌株数超过4株，应增加相应的供试品份数），每一容器接种一种试验菌，1g或1mL供试品中接菌量为105～106cfu，接种菌液的体积不得超过供试品体积的1%，充分混合，使供试品中的试验菌均匀分布，然后置20～25℃避光贮存。（3）存活菌数测定

根据产品类型，按表7-1、7-2、7-3规定的间隔时间，分别从上述每个容器中取供试品1mL（g），测定每份供试品中所含的菌数，测定细菌用胰酪胨大豆琼脂培养基，测定真菌用沙氏葡萄糖琼脂培养基。存活菌数测定方法及方法适用性试验照微生物计数法进行。每株试验菌应进行平行测定，以算数平均值作为计数结果。方法适用性试验中，试验菌的回收比值应在0.5~2范围内。计算1mL（g）供试品各试验菌所加的菌数及各间隔时间的菌数，并换算成lg值。表7-1注射剂、眼用制剂、用于子宫和乳腺的制剂抑菌效力判断标准微生物种类抑菌效力标准减少的lg值6h24h7d14d28d细菌A23——NRB—13—NI真菌A——2—NIB———1NI表7-2耳用制剂、鼻用制剂、皮肤给药制剂、吸入制剂抑菌效力判断标准微生物种类抑菌效力标准减少的lg值2d7d14d28d细菌A23—NIB——3—真菌A——2NIB——1NI表7-3口服制剂、口腔粘膜制剂、直肠给药制剂抑菌效力判断标准微生物种类减少的lg值14d28d细菌3NI真菌1NINR（norecovery）：试验菌未恢复生长。NI（noincrease）：未增加，是指对前一个测定时间，试验菌增加的数量不超过0.5lg。三、结果判断

供试品抑菌效力评价标准见表7-1、7-2、7-3，表中的“减少的lg值”是指各间隔时间测定的菌数lg值与1mL（g）供试品中接种的菌数lg值的相差值。表中“A”是指应达到的抑菌效力标准，特殊情况下，如抑菌剂可能增加不良反应的风险，则至少应达到“B”的抑菌效力标准。四、注意事项1.抑菌效力可能受试验用容器特征的影响，如容器的材质、形状、体积及封口的方式等。因此，只要供试品每个包装容器的装量足够试验用，同时容器便于按无菌操作技术接入试验菌液、混合及取样等，一般应将试验菌直接接种于供试品原包装容器中进行试验。若因供试品的性状或每个容器装量等因素需将供试品转移至无菌容器时，该容器的材质不得影响供试品的特性（如吸附作用），特别应注意不得影响供试品的pH值，pH值对抑菌剂的活性影响很大。2.抑菌剂的抗菌效力在贮存过程中有可能受多种因素影响，因此，本试验方法和抑菌剂抑菌效力判断标准也仅限于包装未启开的成品制剂。其目的是验证成品制剂中的抑菌剂效力在效期内不因贮藏条件而降低，从而为药品筛选出安全、有效、质量可控、科学合理的抑菌剂种类。3.如果药物的抑菌性较强，无适宜的中和剂或其他消除供试品抑菌活性的方法，采用较高稀释（如10-3或10-4）可满足存活菌数测定方法适用性的要求，则采用此方法进行抑菌效力测定时，可以依据对数减少值的可接受标准，接受较高试验菌（如1g或1mL供试品中接菌量为107~108cfu）。第二节降压物质检查

降压物质系指某些药品中含有能导致血压下降的物质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。一、基本原理

本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。二、基本步骤试验前准备（设备、器材、试剂、需配制的溶液、实验动物）操作过程（动物的麻醉和手术、测压装置和记录仪的调节、动物灵敏度的测定、给药）三、结果判断

dT≤dS的一半:符合规定dT>dS的一半:不符合规定应按上述次序继续注射一组4个剂量，并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT剂量所致的反应值（1）dT≤dS：符合规定（2）dT>dS：不符合规定；应另取动物复试。如复试的结果仍有dT>dS所致的反应值：不符合规定。四、注意事项试验中需要注意调整供试品溶液的浓度，使注射体积与对照组相同。如需在同一只动物上测定多个样品时，需再经过灵敏度检查，如仍符合要求，方可进行实验，以此类推。实验过程中要注意给动物保温，可用恒温手术台或者手术灯照明，以便动物血压稳定。动物的麻醉根据实验室的经验可单戊巴比妥钠溶液40~55mg/(ml•kg)腹腔注射麻醉，也可用其它适宜的麻醉剂进行麻醉。如果将动物气管切口时，注意清除气管中的血液凝块（一般用脱脂棉），以防动物呼吸困难，影响血压稳定。所用动物经灵敏度检查如仍符合要求，可继续用于降压物质检查。第三节升压物质检查升压物质系指从动物神经垂体中提取或用化学方法合成的催产素中所含的能引起血管收缩、血压升高的物质。一、基本原理

本法系比较赖氨酸升压素标准品（S）与供试品（T）升高大鼠血压的程度，以判定供试品中所含升压物质的限度是否符合规定。二、基本步骤试验前准备（设备、器材、试剂、需配制的溶液、实验动物）操作过程（动物的麻醉和手术、稳定血压、动物灵敏度测定、给药）三、结果判断

dT≤dS所致反应的一半:符合规定dT>dS的一半:不符合规定应按上述次序继续注射一组4个剂量，并按相同方法分别比较两组内各对dS、dT剂量所致的反应值（1）dT≤dS：符合规定（2）dT>dS：不符合规定；应另取动物复试。如复试的结果仍有dT>dS所致的反应值：不符合规定四、注意事项选用雄性大鼠，体重在300~450g，其灵敏度较高，血压相对稳定，实验更容易成功。供试品和对照品注射容量和注射速度应一致，否则会影响对照品血压升高的幅度。实验前，必须按《中国药典》（2025年版）规定进行动物灵敏度的测定，符合要求才可以用于升压物质检查。所用动物经灵敏度检查如仍符合要求，可继续用于升压物质检查。第四节组胺类物质检查组胺是一种活性胺化合物，由组氨酸在脱羧酶的作用下产生的。许多组织，特别是皮肤、肺和肠黏膜的肥大细胞中含有大量的组胺。

组胺可影响细胞反应，引起过敏反应、炎症反应、胃酸分泌等。一、基本原理

本法系比较组胺对照品（S）与供试品（T）引起豚鼠离体回肠收缩的程度，以判定供试品中所含组胺类物质的限度是否符合规定。二、基本步骤试验前准备（设备、器材、溶液配制、实验动物，使用的溶液包括对照品溶液、对照品稀释液、供试品溶液、回肠肌营养液等）操作过程（动物手术、试验设备调节、给药）三、结果判断

如供试品溶液引起回肠收缩：dT≤dS1所致反应值，符合规定；dT>dS1所致反应值，不符合规定应另取动物按初试方法进行复试，复试结果若dT≤dS1所致反应值，符合规定；只要一个dT>dS1所致反应值，不符合规定。

如供试品不引起回肠收缩，则按照限值剂量在供试品溶液中加入组胺对照品高、低剂量，并按下列次序准确注入dS2、dS1+T、dS2+T、dS1，重复一次，若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量的收缩基本一致，可判定供试品组胺类物质检查符合规定；若供试品组胺溶液产生的收缩与对应组胺对照液高、低剂量的收缩不相符，即减少或无收缩，或不能重复出现，则此试验结果无效，应另取动物重试。组胺类物质检查不能得到有效结果时，可进行供试品的降压物质检查。调节剂量使低剂量dS1所能引起回肠收缩，高剂量dS2不致使回肠收缩达极限，且高低剂量所致回肠的收缩应有明显差别，可以重复出现。低剂量dS1所致反应值约为高剂量dS2的一半，高低剂量的比值（r）为1：0.5左右。四、注意事项

（1）豚鼠对组胺类药物很敏感，可引起支气管痉挛性哮喘，常用于药物药效的测试模型。常用实验动物接受致敏物质的反应程度不同，其顺序为：豚鼠>兔>犬>猫>蛙。（2）浴槽中可事先加入约10~30ml的回肠肌营养B液，浴槽液体的容量应相等。第五节过敏物质检查过敏物质检查是一种检查异性蛋白的实验方法。异性蛋白进入人体，可引起过敏反应，轻者皮肤潮红、发痒、荨麻疹，严重者支气管痉挛、窒息甚至过敏性休克、死亡。一、基本原理

本法系将一定量的供试品溶液注入豚鼠体内，间隔一定时间后静脉注射供试品溶液进行激发，观察动物出现过敏反应的情况，以判定供试品是否引起动物全身过敏反应。二、基本步骤试验前准备（设备、器材、试剂、溶液配制、实验动物豚鼠6只，豚鼠250g-350g）操作过程（致敏、激发）三、结果判断

静脉注射供试品溶液30分钟内，不得出现过敏反应。如在同一只动物上出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、连续咳嗽3声、紫癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳或倒地、抽搐、休克、死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。四、注意事项做过本实验的豚鼠不得重复使用。致敏的途径尽可能拟用临床给药途径。第六节溶血与凝集检查

溶血系指红细胞破裂、溶解，血红蛋白逸出的一种现象。可由多种理化因素和毒素引起。

凝集反应是一种血清学反应，是颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电解质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。一、基本原理

本法系将一定量供试品与2%的家兔红细胞混悬液混合，温育一定时间后，观察其对红细胞状态是否产生影响的一种方法。二、基本步骤试验前准备（设备、器材、试剂、溶液、实验动物等，溶液包括2%红细胞混悬液、供试品溶液）操作过程（按照下表依次加入溶液，混匀后在37℃±0.5℃恒温箱中温育，3h后观察溶血和凝聚反应）溶液试管编号1、23452%红细胞悬液/ml2.52.52.5

0.9%氯化钠溶液/ml2.22.5

4.7纯化水/ml

2.5

供试品溶液/ml0.3

0.3三、结果判断

当阴性对照管无溶血和凝聚发生，阳性对照管有溶血发生，若2支供试品管中的溶液在3小时内均不发生溶血和凝聚，判定供试品符合规定若有1支供试品管的溶液在3小时内发生溶血和（或）凝聚，应设4支供试品管进行复试，其供试品管的溶液在3小时内均不得发生溶血和（或）凝聚，否则判定供试品不符合规定。四、注意事项

在2%红细胞混悬液的制备过程中，要求1000

~1500

r/min离心15分钟，除去上清液，洗涤2~3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9%氯化钠溶液配成2%的混悬液，供试验用。谢谢观看第八章生物检定统计法目录01概述02直接测定法03量反应平行线测定法04四参数回归计算法05实验结果的合并计算学习目标1.掌握生物检定统计法的类型。2.掌握直接测定法的效价、误差项及可信限计算。3.熟悉量反应平行线测定法的效价、误差项及可信限计算。4.了解平行线设计的实验类型、方差分析和可靠性测验。知识目标学会用计算模板（如excel表等）进行生物检定结果的统计分析。能力目标1.明确认知生物检定统计法的意义。2.在生物检定统计分析过程中，养成严谨的思维习惯。素养目标药品生物检定是通过测定供试品（T）和标准品（S）在生物体上的特定反应而确定药品的效价或毒性。由于实验对象是生物体，而且供试品大多为多组分或结构复杂，检定过程存在很多变化因素，结果带有不确定性，因此借助生物统计法加以解释与检验，使其更具有科学性。第一节概述生物检定统计法主要是应用统计分析的原理，从定量或定性数据出发，设计实验，处理结果，严密、科学地研究药物量效关系的一门学科。一、生物检定统计法二、生物检定统计法有关概念1．生物检定标准品2．供试品3．等反应剂量对比4．生物变异的控制5．误差项6．可靠性测验7．可信限和可信限率第二节直接测定法直接测定法观察的指标为质反应，某些药物注入动物体内后，反应指标（如死亡、惊厥、心跳停止、痉挛、血液或血浆的凝结等）明确可靠，即只有出现与不出现两种情况，所以只能用一组动物中出现正或负反应的百分率来表示，如死亡率、惊厥率等。一、直接测定法及应用第二节直接测定法1．效价计算一、直接测定法及应用2．误差项及可信限计算直接测定法例题：

洋地黄效价测定方法是鸽最小致死量（MLD）法，S为洋地黄标准品，按标示效价配成1.0U/ml的酊剂，临试验前稀释25倍。T为洋地黄叶粉，估计效价AT＝10U/ml，配成1.0U/ml的酊剂，临试验前配成稀释液（1→25）。测得数据如下：解：按照上述公式带入计算，第二节直接测定法常用的统计软件包有SPSS和MICROSOFTOFFICE中的EXCEL组件。以洋地黄效价测定结果为例，采用EXCEL实现运算。二、直接测定法与计算机运算1.建立统计表格二、直接测定法与计算机运算图8-1建立直接测定法的统计表格2.输入已知数据二、直接测定法与计