CN119403919A 生产稳定培养物的方法 （科·汉森有限公司）

2024.12.11PCT/EP2023/0645502023.05.31WO2023/232871EN2023.12.07制备具有改善的稳定性的冷冻或干燥的原核生2(c)冷冻所述组合物以形成冷冻的原核生物中间产品，然后冻干所述中间产品以形成细胞的细胞表面疏水性为至少40并且其中所述产品的效力5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤(iii)在4℃至20℃,优选在低于(Streptococcus)(如嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus))、乳球菌属3(Roseburiafaecis)和盲肠罗斯拜瑞氏菌(Roseburiacecicola)、粪杆菌属菌属(anaerostipes)(如粪厌氧棒杆菌(Anaerostipescaccae))、厌氧丁酸菌属(Anaerobutyricum)(如Anaerobutyricumhallii的种、十二指肠厌氧丁酸菌下种：动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)、长双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve))、丙酸杆菌属(Propionibacterium)(如费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)的种)、丙酸杆菌属(Cutibacterium)(如痤疮丙酸杆菌(Cutibacteriun液乳杆菌(Limosilactobacillusreuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillussalivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacilluscasei)、类干酪乳酪杆菌类干酪亚种(Lacticaseibacillus广布乳杆菌(Latilactobacilluscurvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus酸亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)和惰性乳杆菌(Lactob8.一种包含不产孢子的原核生物的冷冻或干燥产品49.根据权利要求8所述的冷冻或干燥产品，其中所述产品的效力为1E+08CFU/g至1E+5[0001]本发明涉及针对某些细菌，特别是乳酸菌等发酵细菌的冷冻或干燥组合物的领代谢的乳酸菌(LAB)产生乳酸作为糖发酵的主要产物或唯一产物。同型发酵乳酸菌的实例是乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的种、德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)或嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)的种。异位(CFU)的活菌含量。WO2005/080548(Chr.Hansen)公开了丸粒(pellet)冷冻的乳酸菌步骤中，将细胞培养物保持在4℃,目的是限制细胞降解反应。(Fonsecaetal.(2015)6Chapter24:Freeze_DryingofLacticAcidBacteriainWolkers&Oldenhof(Eds),CryopreservationandFreeze_dr着关键作用(BurgainJ,etal(2014)AdvancesinColloidandInterfaceScience多糖。肽聚糖层可以被蛋白质S层覆盖并被各种多糖修饰(Zeidanetal2017,FEMS胞壁进行更深入的表征(sch⃞ir-zammarettiandUbbink(2003)BiophysicalJournal将其改进为界面粘附曲线的测定，反映了细菌从水相到有机相中的十六烷的分配表面蛋白质的存在与表面的高等电点和高疏水性相关。磷壁酸使表面疏水并带强负电荷。[0013]细胞表面特性的表征以及与细菌生长条件的联系一直是许多研究的主题(sch⃞r-zammarettietal(2005)AEM71,8165–8173；和MillsapK_Wetal(1996)间的联系仅在Zupancic等人的研究(Pharmaceutics2019,11,483；doi:10.3390/MicrobiolBiotechnol(2013)40:85_93,显示细胞表面疏水性和细胞经受后续条件如长期储存的存活力之间的反相关性(inverse[0016]本发明来源于这一预料不到的观察，即如果在下游工艺中加入某些保护剂化合7[0025](c)冷冻组合物以形成冷冻的原核生物中间产品，然后冻干该中间产品以形成冻的细胞表面疏水性为至少40并且其中产品的效力为例如PetroffHausser计数胞/g至2.5E+11原核细胞/g或4.5E+10原核细胞/g至1E+11原核细胞菌(Streptococcusthermophilus))、乳球菌属(Lactococcus)(如乳酸乳球菌珠菌属(Leuconostoc)(如肠膜明串珠菌(Leuconostocm(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、联合乳杆菌属8液乳杆菌属、联合乳杆菌属、慢生乳杆菌属(Lentilactobacillus)、广布乳杆菌属属；真杆菌属(Eubacterium)(如粘液真杆菌(Eubacteriumlimosum)、聚集真杆菌(Eubacteriumaggregans)、巴氏真杆菌(Eubacteriumbarkeri)、迟缓真杆菌(Eubacteriumlentum))、罗斯拜瑞氏菌属(Roseburia)(肠道罗斯拜瑞氏菌菌(Roseburiacecicola)、粪杆菌属(Faecalibacterium)(如普氏栖粪杆菌(Faecalibacteriumprausnitzii)种)、厌氧棒杆菌属(anaerostipes)(如粪厌氧棒杆菌(Bifidobacteriumbreve))、丙酸杆菌属(Propionibacterium)(如费氏丙酸杆菌联合乳杆菌(Ligilactobacillussalivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillussubsp.paracasei)、植物乳植杆菌植物亚种(Lactiplantibacillusplantarum广布乳杆菌(Latilactobacilluscurvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus酸亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactis)、加氏乳杆菌(Lactobacillusgasseri)、约氏乳杆菌(Lactobacillusjohnsonii)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)和嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus[0042]本发明还提供了可通过上述方法获得的包含不产孢子的原核生物的冷冻或干燥9发酵、产丁酸的细菌(如人罗斯拜瑞氏菌(Roseburiahominis)和食葡糖罗斯拜瑞氏菌(Roseburiainulinivorans))、Anaerobutyricumhallii、十二指肠厌氧丁酸菌(Anaerobutyricumsoehngenii)，真杆菌属(Eubacterium)(如粘液真杆菌(Eubacterium属(Limosilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、乳酪杆菌属(Lacticaseibacillus)、乳植杆菌属(Lactiplantibacillus)、粘液乳杆菌(Limosilactobacillus)、联合乳杆菌属(Ligilactobacillus)、慢生乳杆菌属(Lentilactobacillus)、广布乳杆菌属(Latilactobacillus)、伴生乳杆菌属(Companilactobacillus)、广布乳杆菌属氏粘液乳杆菌(Limosilactobacillusrueteri)、鼠李糖乳酪杆菌(Lacticaseibacillusrhamnosus)、唾液联合乳杆菌(Ligilactobacillussalivarius)、干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacilluscasei)、类干酪乳酪杆菌类干酪亚种(Lacticaseibacillus广布乳杆菌(Latilactobacilluscurvatus)、福菜伴生乳杆菌(Companilactobacillus明串珠菌(Leuconostoclactis)、肠膜明串珠菌乳脂亚种(Leuconostocmesenteroides变种(Lactococcuslactissubsp.lactisbiovar.diacetylactis)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、肠球菌属(Enterococcus)如屎肠球菌(Enterococcus杆菌动物亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.animalis)、长双歧杆菌菌(Bifidobacteriumbreve)、瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)、发酵乳杆菌利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)和嗜酸乳杆菌(动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsplactis)BB-12B)、DSM15954；ATCC29682、ATCC27536、DSM13692、DSM10140、LA-5@(嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus))、DSM13241、LGG®(鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus))、ATCC53103、GR-(鼠李糖乳杆菌GR-1@)、干酪乳杆菌431@(L.casei431@)(类干酪乳杆菌类干酪亚种(Lactobacillusparacaseisubsp.paracaseiL.casei)干酪乳杆菌4318)、ATCC55544、F19@(副干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)F198)、LMG_17806、TH-4@(嗜热链球菌TH-4@)、DSM[0053]可通过上述方法获得的包含不产孢子的原核生物的冷冻或干燥产品可用于生产[0055]可通过上述方法获得的包含不产孢子的原核生物的冷冻或干燥产品也可用于制[0056]图1显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥动物双歧杆菌乳酸亚[0057]图2显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥嗜酸乳杆菌LA-5@[0058]图3显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥罗伊氏乳杆菌[0059]图4显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥动物乳杆菌[0060]图5显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)TH-4@HA的BCSH测定的界面粘附曲线。所有数据点都是[0061]图6显示了不含保护剂(FD0)和含保护剂(FD1)的冷冻干燥乳酸乳球菌[0062]图7.(A)37℃贮存稳定性试验中活力损失与不含保护剂的冻干产品的细胞表面疏水性之间的关系。(B)37℃贮存稳定性试验中活力损失与含保护剂的冻干产品的细胞表面[0064]低聚果糖(FOS)，也称为寡聚果糖(oligofructose)或寡果聚糖(oli粉可以通过酶法或化学法降解为具有一般结构Glu–Frun(缩写为GFn)和Frum(Fm)的低聚糖(GF2(F3)和菊粉四糖(F4)。第二类FOS是通过黑曲霉(Aspergillusniger)或曲霉属[0069]保护剂组合物的配方改编自Wolkers&Oldenhof(编辑)的书(CryopreservationandFreeze_dryingProtocols)，第三版(2015)第24章：乳酸菌的冷冻干燥(Freeze_(麦芽糖糊精DE12的商品名，Roque100g；47g_59gGF3/100G[0072]活细胞的计数。采用标准浇注平板法测定嗜酸乳杆菌LA-58、动物乳杆菌LA51、罗伊氏乳杆菌RC-14®的活细胞计数，一式两份。将冻干的物质混悬在无菌蛋白胨盐水稀将细胞悬液在蛋白胨盐水稀释剂中连续稀释。将稀释液一式两份铺在MRS琼脂(BDDifcoTMUbbink((2003)BiophysicalJournal85，4076_4092))的方法应用于改良的缓冲液强度，并在程序的初始步骤中使用细胞洗涤：将0.2g冻干颗粒重悬于10ml100mM磷酸钠缓冲液(BCSH)由粘附在十六烷/水界面上的细菌[0081]使动物双歧杆菌乳酸亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)BB-12@在补充有0.5g/l半胱氨酸盐酸盐和1g/l碳酸钠的MRS培养基(BDDifcoTM乳杆菌MRS肉汤，通过加入24％氨水控制pH设定点6.0。发酵在16小时内完成，此时BB-12@利用了所有的BB-12®FD0和BB-12®FD1。[0082]对来自冻干产品BB-12@FD0和BB-12®FD1的细胞的细胞表面疏水性进行表H/VB)＝0.1时，BB-FD0和BB-12@FD1的细胞表面疏水性分别为44%±[0084]使嗜酸乳杆菌在MRS培养基(BDDifcoTM乳杆菌MRS肉汤，FisherScientific)中生长。用于发酵的接种物通过使菌株在在静态条件下和没有pH控制的情况BB-12@所述，进一步处理细胞浓缩物。LA-5@细胞浓缩物的配制是通过每1gLA-5@细胞浓缩物加入0.5g含22％干物质(w/w)的保护剂来完成的。产生冻干材料LA-5@FD0和LA-5@FD1。[0085]对冻干产品LA-5@FD0和FD1的细胞的细胞表面疏水性进行表征。图2[0087]使罗伊氏乳杆菌RC-14@在MRS培养基(BDDifcoTM乳酸杆菌MRS肉汤，FisherScientific)中生长。用于发酵的接种物通过使菌株在静态条件下和没有pH控制的情况下以300rpm持续搅拌发酵罐中的内容物，温度保持在37℃,且通过加入24％氨水控制pH设定BB-12@所述，进一步处理细胞浓缩物。RC-14@细胞浓缩物的配制是通过每1gRC-14FD1。[0088]对冻干产品RC-14@FD0和FD1的细胞的细胞表面疏水性进行表征。形成，这从界面粘合曲线中间区域的响应增加可以看出。RC-14@FD0和RC-14®FD1在Φ(VH/VB)＝0.1时的细胞表面疏水性分别为64%±3％和83%±3％。这些值将RC-14®的[0090]使动物乳杆菌(Lactobacillusanimalis)LA-5@1在MRS培养基(BDDifcoTM乳杆下进行，顶空含氮。以300rpm持续搅拌发酵罐中的内容物，温度保却至10℃,并在4℃离心浓缩。通过浓缩系数30x制备的细胞浓缩物具有13％(w/w)的干物[0091]对冻干产品LA51FD0和LA51FD1的细胞的细胞表面疏水性进行表征。图4显示=0.1时的细胞表面疏水性分别为29%±4％和23%±2％。这些值将LA51的细胞表面归类[0093]使嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)TH-4@HA在MRS培养基(BD条件下和没有pH控制的情况下在40℃具有MRS培养基