CN119403931A 孤雌生殖方法和组合物 （先锋国际良种公司）

2024.12.18PCT/US2023/0659232023.04.18WO2023/205668EN2023.10.26本文提供了用于通过在雌配子体中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸来诱导孤雌生殖的方法动子以及使用这些启动子在植物的卵细胞中表2向所述植物中引入多核苷酸，所述多核苷酸包含选自由以下组成的组的多核苷酸序其中所述多核苷酸序列驱动可操作地连接的异源2.如权利要求1所述的方法，其中所述可操作地连接的异源多核苷酸序列是编码多肽3.如权利要求2所述的方法，其中所述可操作地连接的6.一种植物，所述植物包含可操作地连接到异源多核苷(c)(a)或(b)的多核苷酸的片段，在雌配子体中表达可操作地连接到在植物卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多序列，其中使所述雌配子体孤雌生殖并在无授粉的情况下形成单倍体胚，并且其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸不在雌配子8.如权利要求7所述的方法，其中所述编码Babyboom(BBM)多3其中所述启动子驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其片段的所述可操作地连接的13.如权利要求7所述的方法，其中在卵细胞中表达所述Babyboom(BBM)多核苷酸之前从经修饰的内源性基因组BBM基因座表达所述Babyboom(BBM)多核苷从经修饰的内源性基因组卵细胞基因座表达所述Babyboom(BBM)多核苷酸，其中所述内源性基因组卵细胞基因座中的卵细胞编码序列或基因组序列被修饰，使得它编码BBM多17.如权利要求7所述的方法，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸已使用基因编辑技术4酶(TALEN)或Cas多肽。19.如权利要求7所述的方法，其中所述雌配子体是单子叶植物或双子叶植物雌配子(a)从单倍体胚再生孤雌生殖植物，所述单倍体胚包含可操作地连接到所述在卵细胞(b)在衍生自所述小麦植物细胞的雌配子体中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸包含编码Babyboom25.如权利要求23所述的方法，其中所述内源性Spo苷酸修饰引入其多核苷酸序列中或将氨基酸修饰引入其多肽28.如权利要求25所述的方法，其中所述核苷酸修饰通过选自由以下组成的组的核酸529.如权利要求25所述的方法，其中所述核苷酸修饰通过由至少一种指导RNA指导的30.如权利要求23所述的方法，其中所述编码Babyboo31.如权利要求23所述的方法，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸选自由以下组成的33.一种在不存在卵细胞受精的情况下从植物中的一个或多个配子体细胞获得克隆无(a)在一个或多个配子体细胞中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的或其保留单倍体诱导活性的片段的核苷酸序列，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸不在雌637.如权利要求33所述的方法，其中所述编码Babyboo38.如权利要求33所述的方法，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸选自由以下组成的7说明书同时提交。包含在此XML格式文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过援引以列是编码Babyboom(BBM)多肽的BBM多核苷酸，该BBM多肽当在雌配子体中表达时诱导单倍8苷酸包含编码Babyboom(BBM)多肽或其片段的核苷酸序列，其中使雌配子体孤雌生殖并在无授粉的情况下形成单倍体胚，并且其中Babyboom(BBM)多核苷酸不在雌配子体中天然表修饰的内源性基因组卵细胞基因座表达Babyboom(BBM)多核苷酸，其中内源性基因组卵细倍体胚的时间段，(b)分离双单倍体胚，以及(c)从步骤(b)的双单倍体胚再生双单倍体植一些方面，该方法包括(a)在小麦植物细胞中阻抑以下的活性：(1)所有内源性Spo11或Osd1多核苷酸或多肽；(b)在衍生自小麦植物细胞的雌配子体中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中Babyboom(BBM)多核苷酸包含编码[0012]本文还描述了在不存在卵细胞受精的情况下从植物中的一个或多个配子体细胞中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中Babyboom(BBM)多核苷酸包含编码Babyboom(BBM)多肽或其保留单倍体诱导活性的片段的9[0013]图1示出了BBM肽序列的比对。(共有序列＝SEQIDNO:112，TA_BBM6A＝SEQID结合结构域在SEQIDNO:111和122中[0016]根据形成本申请的一部分的以下详细描述和随附序列表中可以更全面地理解本本文使用的所有技术和科学术语具有与所公开的方法和组合物所属领域的普通技术人员有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义，除非另有明确说明。子体中表达由可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸编码的子体中的表达可用于诱导母本单倍体诱导，从而导致在不使用授粉的情况下产生单倍体[0034]编码当由在卵细胞中表达的启动子表达时能够诱导在雌配子体中的母本单倍体诱导的BBM多肽或其片段的任何合适的多核苷酸可以用于本公开的方法和组合物中。在一核苷酸序列的全长上比对时与SEQID所示的核苷酸序列具有至少70％、序列同一性的核苷酸序列。“片段”是指编码BBM多肽的核苷酸序列的一部分。该片段可以编码BBM多肽的生物活性部全长核酸序列中的核苷酸数量，例如SEQID肽片段保留BBM多肽的单倍体诱导活性并因此当由在卵细胞中表达的启动子表达时保留其个核苷酸而衍生自SEQID用于本文所述的方法和组合物中的BBM多肽的变体当由在卵细胞中表达的启动子表达时保此紧邻的氨基酸残基。保留BBM多肽的单倍体诱导活性并因此当由在卵细胞中表达的启动子表达时保留它们在雌配子体中诱导母本单倍体诱导的能力的多肽片段。在一些实例中，果源于同一物种的话，则是通过蓄意人为干预对其天然形式在组成和/或基因组基因座方[0041]因为BBM不在雌配子体中天然表达，所以通过将多核苷酸可操作地连接到驱动在多核苷酸转录(即在卵细胞中表达多核苷酸)的任何合适的启动子可以用于本公开的方法实施例中还包括其片段或变体中的任一种。[0046]可以使用本领域技术人员已知的任何卵细胞启动子和/或卵细胞特异性启动子，[植物杂志],51:281_92中公开的卵细胞特异性EC1.1和EC1.2启动子以及US2015/0152430表达由可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸编码的BBM多肽或其片段。如本文所示，BBM多肽在植物的雌配子体中的表达可用于诱导母本单倍体诱[0048]本文公开的卵细胞启动子核苷酸序列和方法可用于调节植物卵细胞中任何异源所示的多核苷酸序列的启动子引入卵细胞中。的能力并因此保留它们在卵细胞中表达异源多核苷[0052]在一些实施例中，改变卵细胞启动子的多核苷酸以产生编码变体的核苷酸序响与其可操作地连接的最小启动子转录的变化。可以例如通过标准DNA诱变技术或者通过提供了包含可操作地连接到至少一个异源序列的核苷酸序列的重组DNA构建体，该核苷酸连接的异源多核苷酸序列编码BBM多肽或其功能BBM片段或BBM变体。卵细胞启动子序列和[0056]本文公开的启动子序列可以包含在重组DNA构建体中或嵌合多核苷酸中，例如与性EME包括但不限于SEQIDNO:30和在公开号WO2018/183878中描述的那些，将其以其全核苷酸。本公开的方法和组合物可以使用具有或不具有EME序列和/或增强子的不同启动因组区域或编码区域中的一个或多个核苷酸，例如以产生编码BBM多肽的经修饰的基因组BBM多肽的异源多核苷酸替换基因组卵细胞基因座中的内源性基因组核苷酸序列或编码核核苷酸序列改变为编码BBM多肽的异源多核苷酸的序列。本文还提供了所得的经修饰的基子的小麦植物的方法。在某些实施例中，相对于小麦植物的内源性Spo11或Prd1、Prd2或PRd3；Rec8以及OSD1多核苷酸和多肽具有阻抑的表达和/或活性的小麦植物关于阻抑是杂[0063]在某些实施例中，这些方法包括阻抑植物或植物细胞中的内源性小麦Spo11或用基因组编辑方法(包括但不限于Cas核酸内切酶和指导RNA)用基因组编辑方法(包括但不限于Cas核酸内切酶和指导RNA)[0065]本领域普通技术人员将容易地认识到在评估或测量在本公开的任何实施例中的酸和多肽具有阻抑的活性的小麦植物关于阻抑是杂合的或纯合的。可以将这些植物杂交、BBM多核苷酸引入基因组卵细胞基因座的编码核苷酸序列或基因组核苷酸序列中。在另一个实例中，该方法包括将卵细胞启动子或调节区引入基因组BBM基因座中。在另一个实例达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中BBM多核苷酸包含编码Babyboom(BBM)多肽或苷酸包含编码Babyboom(BBM)多肽或其片段的核苷酸序麦(T.aestivum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.mocha)、密穗小麦粒小麦(Triticumboeoticum)或驯化形式、栽培一粒小麦(Triticummonococcum)及其种麦(Triticumturgidumssp.durum))、拟二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦倍体小麦属物种的可能祖先，如针对A基因组的乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum)，针对B基因组的拟斯卑尔脱山羊草(Aegilopsspeltoides)和针对D基因组的节节麦(T.tauschii)(也称为方穗山羊草术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的[0077]在一些实施例中，可以使用孤雌生殖诱导方法来改善母学术出版社],1997,48(3):203_207；Kato,A.,MaizeGeneticsCooperationNewsl[玉米遗传学合作简报]1997,36_37；和Wan,Y.等人,TAG[理论碱的量可以是在约400_600mg/L的范围或约500mg/L。培养基中拿草特的量是大约0植物基因的实例包括烟草中的周期蛋白A(Yu等人,2003)、烟草中的周期蛋白D(Cockcroft等人,2000,Nature[自然]4056410_6415；Dewitte等人,2003,PlantCell[植物细胞]15:79_92)、拟南芥中的E2FA(DeVeylder等人,2002,EMBOJ[欧洲分子生物学学会杂志]21:1360_1368)、拟南芥中的E2FB的细胞周期进展(G1/S转变)和细胞分裂时(Gordon_Kamm等人,2002,PNAS[美国科学院院等人2013,PlantJ[植物杂志]75:642_655)。因此，使用卵细胞特异性启动子驱动表达的增加的倍性水平，如在紫花苜蓿(Medicagosativa)中观察到的(Cebolla等人,1999,EMBO在拟南芥中观察到的(Vlieghe等人,2005,CurrentBiol[当代生物学]15:59_63)。预期可遗传学]2011.6:141_146)。乙烯响应元件结合因子相关的两亲性阻遏(EAR)基序介导的转录阻遏在植物中是已知的，包括由LxLxL和DLNxxP的共有序列模式所定义的EAR基序(参见包括WO2013/109754A1和其中引用的所有参考文献中公开的两亲性阻遏基序以及Dr1/DRAP1全局阻遏物复合物(参见US7,288,695B2和其中引用的所有参考文献)，该Dr1/DRAP1全局阻遏物复合物包括与拟南芥MYBL2中发现的基序相似的Dr1基序(参见MatsuiK,UmemuraY,Ohme_TakagiM.2008.PlantJ.[植物用位点特异性重组系统实现多核苷酸在希望的基因组位置处的插入。参见例如，WO99/供用于修饰或改变在植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂的任何合适的Cas[0089]在一些实施例中，可以使用基因组编辑技术将多核苷酸(如卵细胞或BBM多核苷组编辑或基因组工程技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列，包括侧翼染色体基因组序位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷5'或3'非翻译区(UTR)或其他非编码序列以及多核苷酸的其他区域，其中修饰不会对所得[0091]适用于引入位点特异性修饰的Cas多肽包括例如Cas9、Cas12f(Cas_α、Cas14)、体DNA，并且编辑靶多核苷酸序列包括在Cas多肽介导的双链断裂后的非同源末端连接断裂。将断裂的末端结合在一起的最常见的修复机制是非同源末端连接途径(Bleuyard等是缺失、插入或其他重排是可能的(Siebert和Puchta,(2002)PlantCell[植物细胞]14:话，例如非分裂的体细胞中的同源染色体，或DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人,于同源重组的DNA修复模板(Puchta,(1999)Genetics[遗传旦通过核酸内切酶在靶位点引入双链断裂，供体DNA的第一和第二同源区域可以与其相应供的方法导致供体DNA的目的多核苷酸整合到植物基因组中靶位点的双链断裂中，从而改酶介导的位点特异性碱基编辑(Gaudelli等人,Programmablebaseeditingofusinghybridprokaryoticandvertebrateadaptiveimmunesystems.[使用杂交原核和脊椎动物适应性免疫系统进行靶向核苷酸编辑]”Science[科学]353(6305)(2016)；Komor等人,“ProgrammableeditingofatargetbaseingenomicDNAwithoutdouble_strandedDNAcleavage.[在无双链DNA切割时基因组DNA中靶碱基的可编程编辑器转换C_>T(或在相反链上，G_>A)或腺嘌呤碱基编辑器将腺嘌呤转换为肌苷，从而在gRNA指定的编辑窗口内导致A_>G变化。任何影响核碱基变化的分子都是“碱基编辑剂”。[0100]Cas核酸内切酶由指导核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将(Cpf1)、Cas12b(C2c1蛋白)、Cas13(C2c2蛋白)、Cas12c(C2c3蛋白)、Cas12[0103]核酸内切酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割酶，这些识别位点典型地更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请PCT/USDNA底物中的一些序列多态性。对于兆核酸酶的命名约定相似于对其他限制性核酸内切酶在植物或其他生物的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(Miller等人(2011)Nature列的多肽。ZFN包括连接至非特异性核酸内切酶结构域(例如来自Ms型核酸内切酶，例如Fokl的核酸酶结构域)的工程化DNA结合锌指结[0104]可以将催化活性和/或失活的Cas核酸内切酶融合至异源序列(2014年3月6日公开以是已在植物中表征的任何已知阻遏基序。表达的指导RNA(gRNA)与dCAS9_REP蛋白结合，并靶向dCAS9_REP融合蛋白与启动子(T_DNA内的启动子)内特定的预定核苷酸序列的结合。例如，如果使用ZM_UBIPRO::dCAS9_REP::PINIITERM盒和U6_POLPRO::gRNA::U6TERM盒将其表达在边界外，且gRNA被设计成指导dCAS9_REP蛋白以结合T_DNA内表达盒SB_UBIPRO::moPAT::PINIITERM中的SB_UBI启动子，任何整合了边界外序列的事件会是双丙阻遏物融合的dCAS9蛋白(与TETR或ESR相反)的优点是能够将这些阻遏物靶向T_DNA内的任合的合成的锌指核酸酶代替gRNA和dCAS9_REP(Urritia等人,2003,GenomeBiol.[基因组[0105]来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA将Cas核酸内切酶指导至活CRISPRRNA)碱基配对形成RNA双链体的区域，该RNA双链体引导Cas核酸内切酶切割DNA靶。如本文所用，术语“指导核苷酸”涉及两个RNA分子_包含可变靶向结构域的crRNA列的可变靶向结构域和可以与Cas核酸内切酶相互内切酶能够在DNA靶位点引入双链断裂。Cas核酸内切酶(作为单一效应蛋白或与其他组分的前间隔子邻近基序(PAM)位于或相邻于DNA靶序列的3'末端，则通过Cas核酸内切酶对靶序列进行的此类识别和切割典型地会发生。可替代地，本文中的Cas核酸内切酶可能缺乏参见2015年3月19日公布的美国专利申请US20150082478和2015年2月26日公布的[0110]Cas核酸内切酶和效应蛋白可以用于靶向的基因组编辑(经由单个和多个双链断裂和缺口)和靶向的基因组调节(经由将表观遗传效应子结构域系链到Cas蛋白或sgRNA)。Cas核酸内切酶还可以被工程化作为RNA指导的重组酶起作用，并且经由RNA系链可以充当用于组装多蛋白和核酸复合物的支架(Mali等人,2013NatureMethods[自然方法]第10卷:核苷酸序列结构域与可识别Cas核酸内切酶的第二核苷酸序列连接，使得该第一和第二核[0115]指导多核苷酸可以是包含cr核苷酸序列(例如crRNA)和tracr核苷酸(例如[0116]在本公开的一方面，指导核苷酸包含II型CRISPR/Cas系统中的可以与II型Cas核内切酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植包含可操作地连接到植物特异性启动子的相应指导DNA序列，该植物特异性启动子能够在[0118]在一方面，经由粒子轰击或使用所公开的用于重组DNA构建体的农杆菌转化的方[0119]在一方面，指导RNA/Cas9核酸内切酶复合物的RNA是包含双链体crRNA_tracrRNA[0124]cr核苷酸包括可以与靶DNA中的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列区域(称为可变靶向结构域或VT结构域)和作为Cas核酸内切酶识别(CER)域的一部分的第二核苷酸序列Cas核酸内切酶识别结构域或CER结构域。CER结构域能够与Cas核酸内切酶多肽相互作用。可以存在于本文公开的cr核苷酸中的、细菌和古细菌中天然存在的crRNA片段的大小可以RNA)包含(i)与CRISPRII型crRNA的重复区退火的序列和(ii)含茎环的部分(Deltcheva等其中指导多核苷酸/Cas核酸内切酶复合物(还称为指导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统)可选地使靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)靶位点。(2015年3月19日公开的US20150082478和2015年2月26日公开的[0126]指导多核苷酸也可以是包含连接至tracr核苷酸序列的cr核苷酸序列的单分子(也称为单指导多核苷酸)。单指导多核苷酸包含可以与靶DNA中的核苷酸序列杂交的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向(VariableTargeti指导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间隔子)相邻的随机DNA序inMolecularBiology[分子生物学技术](MacMillanPublishingCompany,NewYork[麦性的氨基酸取代的指南，例如，在Dayhoff等人,(1978)AtlasofPrStructure[蛋白质序列和结构图谱集](NatlBiomedResFound,Washington,D.C.[国家[0131]待编辑的核苷酸可以位于由Cas核酸内切酶识别和切割的靶位点的内部或外部。在一个实施例中，该至少一个核苷酸修饰不是由Cas核酸内切酶识别和切割的靶位点上的异性去除在靶向位点处或其附近处降低或完全破坏序列功[0133]指导多核苷酸/Cas核酸内切酶诱导的靶向突变可以发生在位于由Cas核酸内切酶[0134]用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的方法可以是通过恢复无功能基因产物[0137]可以采用多种方法和组合物来产生具有经由本文所述的CRISPR一Cas系统组分的的同源的第一区域和第二区域。供体DNA的同源的第一区域和第二区域分别与存在于细胞或生物基因组的靶位点中或位于该靶位点侧翼的第一和第二基因组区后期细胞，在这些细胞中内源性HR机制的功能预计会大大降低(Mali等人,2013Nature[0140]指导多核苷酸/Cas核酸内切酶系统可以与至少一个多核苷酸修饰模板组合使用以允许编辑(修饰)目的基因组核苷酸序列。(还参见2015[0141]已经描述了指导RNA/Cas核酸内切酶系统的进一步用途(参见例如：2015年3月19日公开的US20150082478，2015年2月26日公开的WO2015026886，2015年2月26日公开的2016025131)并包括但不限于修饰或替换目的核苷酸序列(如调节元件)、目的多核苷酸插[0144]可以使用多种瞬时转化方法，将多核苷酸或重组DNA构建体提供至或引入原核和真核细胞或生物体中。这种瞬时转化法包括但不限于将多核苷酸构建体直接引入植物中。可以通过任何方法将核酸和蛋白提供至细胞，该方法包括使用分子来促进指导的Cas系统2011年2月10日公布的US20110035836和2015年1月7日[0146]可以使用多种方法来鉴定在靶位点处或靶位点附近具有改变的基因组的那些细[0148]在一方面，基因组靶位点含有至少一组与T_DNA表达盒上的那些相对应的不相同于提高含有不相同重组位点的植物的发育效利于将希望的基因和核苷酸序列定向靶向到先前引入靶植物基因组间的序列切除(如果有的话)以显著低于核苷酸序列重组介导的交换靶向排列到植物基因[0152]在适当的情况下，可以对待插入植物基因组中的核苷酸序列进行优化以增加表[0153]已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达并及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的G_C含量调整至通过参考宿[0155]FRT突变位点可用于实践所公开的方法。尽管突变FRT位点是已知的(参见WO序列在植物基因组中靶向插入和表达。因此，可以基于本公开构建和使用其他突变FRT位与含有具有相应不相同重组位点的T_DNA表达盒的载体一起导致重组。将位于侧翼重组位点之间的T_DNA表达盒的核苷酸序列与位于侧翼重组位点之间的靶位点的核苷酸序列进行[0158]另一个变型包括提供与生物体中的靶位点可操作地连接的启动子或转录起始[0161]在雌配子体中表达可操作地连接到在植物卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸包含编码Babyboom(BBM)多肽或其片段酸序列；[0175]实施例5.如实施例1所述的方法，其中核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表[0180]实施例7.如实施例1所述的方法，[0181]实施例8.如实施例1所述的方法，其中与驱动的Babyboom(BBM)多核苷酸的表达造成的单倍体诱导频率相比，由包含表达调节元件的卵细胞启动子驱动的所述Babyboom(BBM)多核苷酸的表达增加所述雌配子体的单倍体诱[0183]实施例10.如实施例1所述的方法，所述方法进一步包括：修饰内源性Babyboom[0187]从经修饰的内源性基因组卵细胞基因座表达所述Babyboom(BBM)多核苷酸，其中[0188]实施例13.如实施例1所述的方法，其中已使用基因编辑技术将所述Babyboom(Cpf1)、Cas12b(C2c1蛋白)、Cas13(C2c2蛋白)、Cas12c(C2c3蛋白)、Cas12d、[0197](a)从单倍体胚再生孤雌生殖植物，所述单倍体胚包含可操作地连接到所述在卵[0200]实施例19.一种用于获得产生[0205](b)在衍生自所述小麦植物细胞的雌配子体中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的Babyboom(BBM)多核苷酸，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸包含编码[0208]实施例21.如实施例19所述的方法，其中通中或将氨基酸修饰引入其多肽序列中来阻抑所述内源性Spo11多核苷酸或多肽、Rec8多核[0209]实施例22.如实施例21所述的方法[0210]实施例23.如实施例21所述的方法(Cas_β)、Cas12a(Cpf1)、C核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表一一[0223]实施例28.如实施例19所述的方法，其中所述Babyboom(BBM)选自由以下组成的酸序列；[0229]实施例29.一种在不存在卵细胞受精的情况下从植物中的一个或多个配子体细胞[0230](a)在一个或多个配子体细胞中表达可操作地连接到在卵细胞中表达的启动子的或其保留单倍体诱导活性的片段的核苷酸序列，其中所述Babyboom(BBM)多核苷酸不在雌[0234]实施例31.如实施例30所述的方法核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表[0246]实施例35.如实施例29所述的方法，其中所述Babyboom(BBM)选自由以下组成的酸序列；[0252]实施例36.一种调节植物细胞的基因组基因座中内源性多核苷酸的表达的方法，[0253]修饰包含编码BBM多肽的内源性多核苷酸的基因组基因座的调节区中的一个或多个核苷酸以产生经修饰的调节区，其中产生所述经修饰的调节区导致所述BBM多肽在雌配[0254]实施例37.如实施例36所述的方法，酸序列；[0261]实施例39.如实施例36所述的方法[0262]实施例40.如实施例36所述的方法，核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表[0267]实施例42.一种植物细胞的经修饰的编码BBM多肽的内源性多核苷酸的经修饰的调节区，其中所述调节区中的一个或多个核苷酸序列；[0274]实施例44.如实施例42所述的[0275]实施例45.如实施例42所述的核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表[0279]实施例46.如实施例42所述的[0280]实施例47.一种调节植物细胞的基因组基因[0281]修饰内源性基因组卵细胞基因座的基因组序列或编码序列以产生包含编码BBM多肽的异源多核苷酸的经修饰的基因组序列或编码序列，其中所述修饰导致所述BBM多肽在[0282]实施例48.如实施例47所述的方法，其酸序列；[0300]实施例51.如实施例47所述的核苷酸的片段，其中所述片段保留其驱动编码所述Babyboom(BBM)多肽或其所述片段的所述可操作地连接的Babyboom(BBM)多核苷酸表[0304]实施例52.一种植物细胞的经修饰的[0305]实施例53.如实施例52所述的经修酸序列；[0317]实施例55.如实施例52所述的经修饰的[0322]实施例57.一种重组DNA构建体，所述选自由以下组成的组的多核苷酸序列：[0340]评价编码BBM肽的多核苷酸(这些多核苷酸与在母本组织或单倍体细胞中具有活性的调节元件连接)在小麦的卵细胞中诱导孤雌鉴定编码BBM型转录因子肽的多核苷酸。小麦BBM肽与来自另外的单子叶植物物种的BBM肽[0343]制备表达盒以使用小麦TA_BBM3A序列(ZM_ODP2(SEQIDNO:13、14)的直系同源核苷酸(SEQIDNO:1)，该多核苷酸可操作地连接到调节元件ZM_DD45PRO(SEQIDNO:15)。在另一个实例中，PvEC1PRO:TA_BBM3A表达盒含有编码TA_BBM3A肽的多核苷酸(SEQ[0345]设计这些表达盒并将其用作孤雌生殖因子以诱导卵细胞分化成胚细胞并启动胚发生。将这些表达盒包含在用于对小麦系SBC0456D进行农杆菌属(Agrobacterium)介导的整合到植物基因组中的T_DNA的左边界和右边界内的多个不同元件的拷贝数和转基因完整性启动子驱动的小麦BBM多核苷酸在胚囊细胞(特别是卵细胞)中或附近的表达刺激卵细胞色体和相对DNA含量。使用从叶组织分离的核的流式细胞术分析来确定T1子代中单独植物[0346]对单倍体子代的评价展示了小麦BBM多核苷酸序列诱导孤雌生殖的能力。使用单倍体子代的数量除以检查的子代的总数来对每个独特事件的单倍体子代的百分比(％)进31.03％至48.57％HI频率的范围，并且显示出41.56％HI频率的平均比率，标准差为6.97如表1中所示。类似地，通过流式细胞术评价来自含有表达盒ZM_DD45PRO::TA_在本公开的方法中使用以下调节元件：如US2015/0152430中公开的那些(启动子包括但不[0353]在本实例中使用BBM型转录因子(如公开号US20210180077中公开的那些，将其通单倍体子代测定以评价来自不同物种的BBM基因是否在小麦中启动孤雌生殖。将编码另外的BBM肽的DNA多核苷酸序列(SEQIDNO:13连接到在雌配子发育期间有活性的PvEC1启动[0357]通过流式细胞术评价来自含有玉蜀黍BBM型序列(具有表达盒PvEC1PRO::ZM_ODP2和Pv_EC1PRO:ZM_BBM2)的转基因事件的子代，以确定小麦中单倍体子代的频率。PvEC1PRO::ZM_ODP2表达盒显示出43.1％HI频率的平均比率，标准差为12.2并且Pv_EC1PRO:ZM_BBM2表达盒显示出42.8％HI频率的平均比率，标准差为10.4如表3中所示。平均比率，标准差为8.5并且Pv_EC1P均比率，标准差为11.0并且Pv_EC1PRO:SV_BBM2表达盒显示出44.1％HI频率的平均比和AT_DD65启动子)和US2018/0094273中公开的那些(玉蜀黍卵细胞启动子)(US2015/以将表达调节元件(如公开号WO2018/18387[0363]可以将编码可操作地连接到含有至少一个EME的调节元件的TA_BBM3A的表达盒用修饰ZM_DD45PRO(SEQIDNO:15)。EME位置指示插入每个相应EME序列的TATA盒上游的DNA[0367]使用表4中所示的经修饰的调节元件来改变雌配子发生期间的mRNA转录水平，从而与如实例1中所述的可操作地连接到包含命名为ZM_DD45PRO(SEQIDNO:15)的DNA片段有编码TA_BBM3A肽的多核苷酸(SEQIDNO:1)，该多核苷酸可操作地连接到调节元件ZM_100)::TA_BBM3A表达盒含有编码TA_BBM3A肽的多核苷酸(SEQIDNO:1)，该[0368]对单倍体子代的评价展示了可操作地连接到小麦TA_BBM3A多核苷酸序列的经修细胞术评价来自含有表达盒ZM_DD45PRO::TA_BBM3A、ZM_DD45PRO:(1XZM_AS呈28.5％HI频率的平均比率，以及ZM_DD45PRO(2XZM_AS2_100)PRO::TA_BBM3A表达盒呈[0369]表5.在具有经修饰的调节元件ZM_DD45PRO的转基因事件的T1子代中的单倍体诱[0372]本公开的方法还可以使用具有或不具有EME序列的不同启动子，以改进如本文所[0374]在小麦(wheat/Triticumaestivum)基因组DNA参考物中鉴定卵细胞特异性或优选表达的基因。在小麦基因组中在4号部分同源染色体上鉴定编码调节元件序列的多核苷白可操作地连接并在雌配子发育期间观察荧光信号来将基因表达的时空模以进一步优化孤雌生殖母本单倍体诱导水平。将编码TA_BBM3A和TA_BBM6A肽的DNA多核苷酸序列可操作地连接到在雌配子发育期间有活性的天然小麦启动子TA_EGGPRO和TA_EC[0377]制备表达盒以使用小麦TA_EGGPRO(SEQIDNO:37)和TA_ECPRO(SEQIDNO调节元件序列评价孤雌生殖。在一个实例中，TA_EGGPRO:TA_BBM3A和TA_EGGPRO:TA_操作地连接到调节元件TA_EGGPRO(SEQIDNO:37)。在另一个实例中，TA_ECPRO:TA_BBM3A和TA_ECPRO:TA_BBM6A表达盒含有编码TA_BBM3A或TA_BBM6A肽的多核苷酸(SEQID[0378]设计这些表达盒并将其用作孤雌生殖因子以诱导卵细胞分化成胚细胞并启动胚发生。将这些表达盒包含在用于对小麦系SBC0456D进行农杆菌属介导的转化的构建体中，中的T_DNA的左边界和右边界内的多个不同元件的拷贝数和转间，由卵细胞特异性启动子驱动的小麦BBM多核苷酸在胚囊细胞(特别是卵细胞)中或附近含有一半数量的染色体和相对DNA含量。使用从叶组织分离的核的流式细胞术分析来确定[0380]对单倍体子代的评价展示了天然小麦卵细胞启动子与天然小麦BBM多核苷酸序列件的评价具有45.3％HI的平均值，标准差为12.4并且含有表达盒TA_EGGPRO::TA_BBM3A的转基因事件具有35.1％HI的平均值，标准差为9.5％(表6)。对含有表达PRO::TA_BBM6A的转基因事件的[0383]因此，含有天然小麦启动子和BBM相关多核苷酸序列的表达盒足以驱动小麦系统够驱动在卵细胞中表达的调节元件。尽管TA_BBM3A和TA_BBM6A仅具有34.9％的序列同源[0385]将编码BBM肽的小麦多核苷酸与在单倍体细胞或组织中有活性的调节元件(例如保留起始密码子和保守基序B、A和AP2DNA结合结构域。在另一个变型中，通过截短TA_N_结构域和C_结构域以仅含有起始密码子和碱基对328至1980以及终止密码子来产生TA_[0390]制备表达盒以使用经修饰的小麦TA_BBM3A序列评价孤雌生殖。在一个实例中，PvEC1PRO:TA_BBM3A(ALT1)表达盒含有编码TA_BBM3A(ALT1)肽的多核苷酸(SEQIDNO:41)，该多核苷酸可操作地连接到调节元件PvEC1PPvEC1PRO:TA_BBM3A(ALT2)表达盒含有编码TA_BBM3A(ALT2)肽的多核苷酸(SEQIDNO:以使用经修饰的小麦TA_BBM6A序列评价孤雌生殖。在一个实例中，PvEC1PRO:TA_BBM6A地连接到调节元件PvEC1PRO(SEQIDNO:19)。在另一个实例中，PvEC1PRO:TA_BBM6A[0391]对单倍体子代的评价证明了经修饰的BBM肽在与PvEC1PRO调节元件可操作地连接时诱导孤雌生殖的能力。如先前所述确定HI频率。对含有表达盒PvEC1PRO::TA_BBM3A(ALT1)的转基因事件的评价具有27.2％HI的平均值，标准差为9.8并且含有表达盒外，对含有表达盒PvEC1PRO::TA_BBM6A(ALT1)的转基因事件的评价具有2.6％HI的平均[0392]表8.在具有小麦BBM多核苷酸和肽截短的转基因事件的T1子代中的单倍体诱导[0396]为了获得最佳的孤雌生殖表型，如实例4中所示，针对驱动转基因小麦植物中的TA_BBM卵细胞特异性或优选表达来评价与TA_BBM多核苷酸可操作动子进行修饰以包括替代的卵细胞特异性/优选启动子或卵细胞特异性/优选序列基序(还包括天然启动子序列或替代天然启动子序列)可修饰表达模式。预期单个TA_BBM部分同源物的这种经修饰的卵细胞表达模式在小麦中诱[0399]在天然基因座的修饰期间使用的DNA试剂(包括但不限于指导RNA、Cas多肽如择性标记对于新产生的BBM等位基因的功能不是必需的，并且可以通过本领域技术人员已动子TA_EGG(SEQIDNO:37)通过同源重组插入TA_BBM基因座，例如如IWGSCv1.0麦参考序列组装和注释中所述的TraesCS3A02G395500或TraesCS6A02G229500，所以此TA_[0400]为了用TA_EGG启动子取代TA_BBM的天然启动子并进入小麦TA_BBM基因的5'UTR如下20_bp可变靶向结构域的gRNA的5'端，该可变靶向结构域靶向TA_BBM启动子的5'上游区域中的基因组序列；并且gRNA中的一种可以包括含有如下20_bp可变靶向结构域的gRNA的5'端，该可变靶向结构域靶向TA_BBM启动子的3'上游区域中(优选地靠近ATG起始密码是两个基因组DNA片段(HR1和HR2)，这些片段衍生自基因组靶序列的上游和下游区域并与物。可以通过对上述扩增产物测序来进一步表征成功的启动子交换事件。预期成功的TA_EGGPRO:TA_BBM启动子交换事件诱导孤雌生殖并导致如实例4中所述的编码序列进行修饰以包含替代的BBM编码序列以替代天然编码序列可修饰BBM多核苷酸的表达模式。预期在卵细胞特异性/优选启动子下游引入BBM编码序列在小麦中诱导孤雌生[0406]为了用TA_BBM编码序列取代TA_EGG的天然编码序列并进入小麦TA_BBM基因的5'含有如下20_bp可变靶向结构域的gRNA的5'端，该可变靶向结构域靶向TA_EGG启动子的3'上游区域中(优选地靠近ATG起始密码子)的基因如下20_bp可变靶向结构域的gRNA的5'端，该可变靶向结构域靶向TA_EGG基因座的3'区域翼是两个基因组DNA片段(HR1和HR2)，这些片段衍生自基因组靶序列的上游和下游区域并的TA_EGGPRO:TA_BBM编码序列交换事件诱导孤雌生殖并导致如实例4中所述的单倍体子春季参考序列和组装中鉴定OSD部分同源基因座的编码区域的基因组序列(SEQIDNO:63、[0410]可以鉴定MiMe基因的单独部分同源基因座中