分子生物学（杨洋）第九章分子生物学技术

ChapterNine·TechniquesofMolecularBiology分子生物学技术授课教师：杨洋教授华中科技大学Contents本章内容概览分子生物学核心技术与方法论体系01核酸技术：电泳、酶切、克隆、PCR与杂交02蛋白质技术：分离纯化与分析方法03DNA-蛋白质相互作用研究技术04蛋白质-蛋白质相互作用研究技术CHAPTER01核酸技术NucleicAcidsTechniques：电泳分离、酶切、克隆、PCR与杂交MolecularBiology凝胶电泳基本原理凝胶电泳（GelElectrophoresis）是依据核酸分子的大小、形状和拓扑学性质进行分离的核心技术。DNA和RNA分子带负电荷，在电场中通过胶支持物的孔隙向正极迁移，迁移速率与分子量成反比，从而实现不同大小核酸片段的有效分离。琼脂糖凝胶电泳中DNA条带在紫外灯下的荧光成像DNA和RNA分子因磷酸骨架带均匀负电荷，在电场中从负极向正极移动，迁移方向确定且可预测线状DNA分子的电泳迁移率与分子量成反比，大分子移动慢、小分子移动快胶支持物呈果冻状多孔结构，充当分子筛角色，允许大分子通过但对其施加更大的阻力DNA条带可通过荧光染料染色后在紫外灯下观察，常用染料包括溴化乙锭和更安全的替代染料MOLECULARBIOLOGYDNA拓扑结构对电泳迁移率的影响相同分子量的DNA分子，其电泳迁移速率因拓扑结构不同而存在显著差异。超螺旋DNA因结构紧密、有效体积小，迁移最快；线性DNA居中；缺刻或松散环状DNA因结构舒展、阻力大而迁移最慢。01超螺旋DNA（supercoiled）结构高度紧密压缩，在凝胶孔隙中穿行阻力最小，迁移速率最快最快02线性DNA（linear）构象舒展程度适中，迁移速率介于超螺旋和缺刻DNA之间居中03缺刻或松弛环状DNA（nicked/relaxed）因单链断裂导致超螺旋释放，结构最为松散，迁移最慢最慢04质粒提取样品的电泳结果常出现多条带，正是同一质粒不同拓扑异构体共存的表现多条带GELELECTROPHORESIS两种胶支持物的特性比较聚丙烯酰胺凝胶分辨力极高但分离范围窄（几百bp以内），琼脂糖凝胶分辨力较低但可分离大至几十kb的DNA片段，需根据目标片段大小合理选择。聚丙烯酰胺凝胶Polyacrylamide分辨力极高，可区分仅差1个碱基对的DNA/RNA片段，是DNA测序和SSR分析的首选有效分离范围较窄，通常仅适用于几百bp以内的小片段核酸分离制备涉及丙烯酰胺单体聚合反应，未聚合单体具有神经毒性，操作需注意防护琼脂糖凝胶Agarose分辨力低于聚丙烯酰胺，但分离范围宽，可分离从几百bp到数十kb的大片段DNA制备简便安全，只需将琼脂糖粉末溶解于缓冲液后加热融化、冷却凝固即可使用通过调整浓度（0.5%-2%）可灵活调节凝胶孔径，适配不同大小DNA分离MolecularBiology脉冲场凝胶电泳（PFGE）脉冲场凝胶电泳通过周期性切换电场方向，突破常规电泳无法分离超大DNA片段的瓶颈，在Mb级别实现按大小分离。01技术突破背景常规电泳中超过50kb的DNA分子以相同速率蠕行，无法区分大小差异。PFGE通过交替变换电场方向，使超大DNA分子在凝胶中呈"之"字形前进，实现有效分离。02分离原理机制电场切换时DNA分子必须重新定向才能沿新方向迁移。分子越大，改变方向所需时间越长，迁移速率越慢，从而实现不同大小超大片段的有效分离。03应用范围优势分离范围可达Mb级别（百万碱基对），适用于完整染色体DNA的分离、基因组物理图谱构建以及大型DNA片段的精确分析。04临床与科研价值在微生物分型、流行病学溯源、医院感染控制等领域有重要应用，被世界卫生组织视为细菌基因分型的"金标准"方法。MolecularBiologyRNA电泳的特殊性RNA作为单链分子会通过碱基配对形成广泛的二级和三级结构（如发夹、茎环），这些结构显著干扰其电泳迁移率，使迁移速率无法真实反映分子量。使用乙二醛（glyoxal）等变性试剂处理可消除碱基配对，确保RNA迁移率仅与分子量相关，从而实现准确的大小分析。01RNA与DNA一样带有均匀负电荷，理论上应按分子量大小在电场中分离02RNA单链分子通过分子内碱基配对形成大量二级结构（发夹、茎环等），导致迁移率偏离预期03乙二醛（glyoxal）处理可与鸟嘌呤形成加合物，有效阻止RNA碱基配对，使RNA保持线性构象04变性RNA电泳中迁移率仅与分子量相关，可准确测定RNA大小，是Northern杂交的前处理关键步骤MOLECULARBIOLOGY限制性内切酶（RestrictionEndonuclease）限制性内切酶是细菌的防御系统，能识别DNA上的特异回文序列并精确切割双链，奠定了DNA重组技术和分子克隆的方法论基础。01限制性内切酶源自细菌的限制-修饰系统，是细菌抵御外源DNA（如噬菌体）入侵的天然防御机制。02每种限制酶识别特定的回文序列（palindromicsequence），长度通常为4–8个碱基对，识别特异性极高。03切割方式分两类：在识别序列内切割产生黏性末端（如EcoRI产生5′-AATT突出）或平末端（如SmaI）。04同尾酶（isocaudamer）识别不同序列但产生相同黏性末端，极大增加了DNA重组实验的设计灵活性。MolecularBiologyDNA克隆技术基本流程DNA克隆（DNACloning）是将目的DNA片段插入载体并导入宿主细胞进行大量复制的系统性技术，涵盖基因获取、载体制备、酶切连接、转化及筛选五大步骤。01目的基因获取可通过PCR扩增已知序列、限制酶切基因组DNA、化学合成已知序列或从cDNA文库中筛选获得。02载体选择质粒（<10kb）、λ噬菌体（10–25kb）、黏粒（35–45kb）、BAC（<300kb）和YAC（<2000kb）按容量递增选用。03酶切与连接用相同限制酶分别切割目的片段和载体，产生匹配末端后用T4DNA连接酶催化磷酸二酯键形成。04转化与筛选将重组DNA导入感受态细胞，利用抗性标记和蓝白斑筛选等方法鉴定阳性重组子。MolecularCloning克隆载体的类型与选择策略分子克隆载体的选择核心依据是目的DNA片段的长度。从小到大有质粒、λ噬菌体、黏粒、BAC和YAC等多种载体可选，容量从数kb跨越到2000kb。理想载体必须具备复制起点（ori）、多克隆位点（MCS）和选择标记基因三大元件，以确保在宿主细胞中稳定复制和高效筛选。常用克隆载体类型与特性比较载体容量从质粒的10kb到YAC的2000kb递增，选择时需匹配目的片段大小载体类型插入容量宿主细胞主要特点质粒

Plasmid<10

kb大肠杆菌操作最简便，最常用的小片段克隆载体λ噬菌体10-25

kb大肠杆菌感染效率高，适合构建基因组文库黏粒

Cosmid35-45

kb大肠杆菌含cos位点，兼具质粒与噬菌体优势BAC<300

kb大肠杆菌基于F因子，基因组计划核心载体YAC<2000

kb酵母容量最大，含端粒和着丝粒元件GENEEXPRESSION基因表达技术（GeneExpression）基因表达技术是将克隆的目的基因在宿主细胞中转录翻译为蛋白质的关键技术。表达载体需额外配备强启动子、核糖体结合位点和转录终止信号等调控元件，通过诱导表达系统精确控制蛋白产量。从原核的大肠杆菌到真核的酵母和哺乳动物细胞，多种表达系统为不同性质的重组蛋白提供了灵活的制备方案。表达载体调控元件表达载体在克隆载体基础上增加强启动子（T7、lac等）、RBS和终止子等表达调控元件T7·lac大肠杆菌表达系统操作简便、成本低、产量高，但缺乏真核翻译后修饰能力，不适合复杂蛋白E.coli酵母表达系统如毕赤酵母，兼具原核操作便利和真核修饰能力，适合分泌型蛋白的大规模生产毕赤酵母哺乳动物细胞表达系统如HEK293、CHO，能完成糖基化等复杂修饰，是治疗性抗体生产的首选HEK293·CHOMOLECULARBIOLOGYPCR基本原理（聚合酶链式反应）PCR通过变性-退火-延伸的温度循环，在体外实现特定DNA片段的指数级扩增。每轮循环含三步：高温变性（94-98°C）、低温退火（50-65°C）、中温延伸（72°C），30个循环可扩增至约10⁹倍。01变性步骤（94–98°C）高温破坏双链DNA的氢键，使模板DNA解链为单链，为引物结合提供条件02退火步骤（50–65°C）温度降至引物Tm值附近，上下游引物分别与模板链的互补序列特异性结合03延伸步骤（72°C）耐热TaqDNA聚合酶从引物3'-OH端开始，按5'→3'方向合成与模板互补的新链04指数扩增每个循环产物量翻倍，n个循环后理论产量为2ⁿ倍，30个循环可实现约10亿倍扩增MolecularBiology·PCRPCR反应体系的核心组分标准PCR反应体系由模板DNA、引物对、dNTPs、耐热DNA聚合酶和含Mg²⁺缓冲液五大组分构成，其中引物设计是PCR成功与否的最关键因素。01模板DNA提供靶序列，可为基因组DNA、cDNA或质粒DNA，用量ng至μg级ng–μg02引物对18-25nt单链寡核苷酸，Tm55-65°C，上下游Tm差值≤2°C18–25nt03dNTPs四种脱氧核苷三磷酸等摩尔混合，各200μM，过高降低保真性200μM04Taq聚合酶源自嗜热水生菌，耐高温不失活，缺乏3'→5'校对活性T.aquaticus05Mg²⁺缓冲液Mg²⁺浓度直接影响退火特异性和酶活性，需优化调整1.5–2.5mMMOLECULARBIOLOGY·PCRTECHNIQUESPCR衍生技术及其应用拓展RT-PCR、qPCR、巢式PCR与多重PCR使PCR从基础研究工具进化为覆盖临床诊断、法医学、食品安全等领域的通用技术平台。逆转录PCR(RT-PCR)先用逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA第一链，再以cDNA为模板进行常规PCR扩增。是检测基因表达水平、克隆真核基因编码序列和分析RNA病毒的核心技术手段。mRNA→cDNA实时荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号（SYBRGreen或TaqMan探针）实时监测每轮扩增产物量，通过Ct值精确定量起始模板。广泛应用于基因表达差异分析、病原体载量检测和SNP分型等领域。Ct值精确定量巢式PCR与多重PCR巢式PCR使用外引物和内引物进行两轮扩增，第二轮以第一轮产物为模板，特异性显著提高。多重PCR在同一反应中加入多对引物同时扩增多个靶标，适用于病原体联合检测和基因分型。双轮扩增·多靶标MOLECULARBIOLOGY分子杂交技术原理与分类基于碱基互补配对，探针与靶序列特异性结合——Southern、Northern、Western三大技术构成分子生物学经典检测体系。杂交原理标记探针在适宜条件下与互补靶序列通过氢键形成稳定双链杂交体，洗去未结合探针后检测信号探针Southern杂交基因组DNA经酶切、电泳分离、变性后转膜，用标记探针检测特定DNA序列的存在与拷贝数DNANorthern杂交总RNA或mRNA经变性电泳后转膜，用探针检测特定基因的表达水平和mRNA大小RNAWesternBlot蛋白质经SDS分离后转膜，用特异性抗体检测目标蛋白的表达量和分子量蛋白MOLECULARBIOLOGY·PROTOCOLSouthern杂交操作流程详解Southern杂交是检测基因组中特定DNA序列的经典方法，由EdwinSouthern于1975年发明。完整流程涵盖基因组DNA酶切、凝胶电泳分离、碱变性、转膜固定、探针杂交与洗涤、信号检测六大步骤，可用于基因拷贝数分析、基因突变检测和RFLP多态性分析等重要研究。01基因组DNA酶切选用合适的限制性内切酶消化基因组DNA，产生覆盖目标区域的特异性片段。酶切条件需优化以确保完全切割，避免星号活性。RESTRICTIONDIGEST02电泳分离与变性琼脂糖凝胶电泳按大小分离DNA片段，碱处理（NaOH）使双链DNA变性为单链。凝胶浓度根据目标片段大小选择，确保良好分辨率。ELECTROPHORESIS03转膜固定毛细管印迹法或电转移将单链DNA从凝胶转至尼龙膜，UV交联或烘烤固定。转膜效率直接影响后续杂交信号强度。BLOTTING04探针标记与杂交用³²P或地高辛、生物素标记探针，在杂交液中与膜孵育结合目标序列。预杂交封闭非特异位点，杂交温度依探针Tm值设定。HYBRIDIZATION05洗涤与检测严格控制洗涤条件去除非特异结合，放射自显影或化学发光成像检测信号。洗涤严谨度决定信噪比，曝光时间需优化避免过曝。DETECTIONChapter02蛋白质技术ProteinTechniques：分离纯化与分析方法PROTEINELECTROPHORESISSDS蛋白质电泳SDS利用SDS使蛋白质变性并包裹均匀负电荷，消除电荷与形状差异，使迁移率仅取决于分子量。分辨率高，可区分差异仅10%的蛋白，是纯度鉴定与分子量测定的标准方法。01SDS变性包裹：SDS（十二烷基硫酸钠）使蛋白质变性展开，并按约1.4gSDS/g蛋白的比例结合，赋予所有蛋白质均匀的高密度负电荷02二硫键断裂：巯基乙醇（β-ME）或DTT断裂亚基间和亚基内的二硫键，确保多亚基蛋白完全解聚为单个多肽链03分子量分离：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率仅与分子量的对数成反比，可通过标准蛋白Marker精确测定未知蛋白分子量04染色检测：考马斯亮蓝染色可检测μg级蛋白，银染灵敏度可达ng级，是评估蛋白纯度和表达量的常用手段SDS凝胶电泳·考马斯亮蓝染色ProteinPurification蛋白质分离纯化策略蛋白质纯化遵循'从粗到精'的分级策略，经盐析和超滤初步浓缩，再通过离子交换与亲和层析逐步提高纯度。粗提液制备通过超声破碎、高压匀浆或酶解法裂解细胞，离心去除细胞碎片获得含目标蛋白的可溶性组分。超声破碎盐析分级利用不同蛋白质在不同盐浓度下溶解度差异（常用硫酸铵），实现初步分组和浓缩。硫酸铵离子交换层析根据蛋白质表面净电荷差异分离，阳离子交换柱结合带正电蛋白，阴离子交换柱结合带负电蛋白。净电荷差异亲和层析利用蛋白质与特定配体的生物亲和力进行高选择性纯化，如His-tag/Ni-NTA、GST/Glutathione。His-tag/Ni-NTAProtocolWesternBlot（蛋白质免疫印迹）WesternBlot是检测和鉴定特定蛋白质的金标准方法，结合了SDS的高分辨分离能力和抗体-抗原反应的高特异性识别能力。01蛋白转移—SDS分离后的蛋白质通过湿转或半干转印迹至PVDF膜或NC膜，保持凝胶中的分子量分布格局PVDF/NC02封闭处理—用5%脱脂奶粉或BSA封闭膜上未结合蛋白的空位，防止后续抗体非特异性吸附产生假阳性信号5%BSA03抗体孵育—一抗特异性识别目标蛋白表位，HRP或AP标记的二抗结合一抗Fc段实现信号级联放大HRP/AP04信号检测—ECL化学发光底物被HRP催化产生发光信号，通过CCD成像系统捕获并定量分析条带灰度值ECL/CCDPROTEOMICS双向电泳与质谱鉴定技术双向电泳（2D）结合等电聚焦和SDS两个维度，可在单一凝胶上同时分离上千种蛋白质，是蛋白质组学差异表达分析的经典工具。差异蛋白点经酶切后通过MALDI-TOF或ESI串联质谱鉴定，利用肽质量指纹图谱（PMF）或肽段序列标签比对数据库确认蛋白质身份，构成了从分离到鉴定的完整蛋白质组学研究流程。第一向等电聚焦（IEF）蛋白质在pH梯度凝胶中迁移至其等电点（pI）位置聚焦，实现基于电荷特性的高分辨率分离pIFOCUSING第二向SDSIEF胶条置于SDS凝胶上方，按分子量进行第二维分离，每个蛋白以二维坐标（pI,MW）定位2DCOORDINATES质谱鉴定挖取差异蛋白点，胰蛋白酶酶切后进行MALDI-TOFMS分析，获得肽质量指纹图谱与数据库匹配鉴定蛋白MALDI-TOF·PMF串联质谱（MS/MS）选择特定肽段母离子进行碰撞诱导解离（CID），获得序列信息，提供比PMF更可靠的蛋白质鉴定结果CID·SEQUENCETAGCHAPTER03DNA-蛋白质相互作用研究技术TechniquesforStudyingDNA-ProteinInteractionMOLECULARBIOLOGY·PROTEOMICSDNA-蛋白质亲和层析DNA-蛋白质亲和层析利用生物素标记的特异DNA序列与链亲和素磁珠偶联，从复杂的细胞核提取物中捕获与之特异性结合的DNA结合蛋白。通过控制结合和洗脱条件，可高效富集目标转录因子，洗脱蛋白经SDS分离和质谱鉴定后，可确定与特定调控元件相互作用的蛋白质身份，是筛选新型转录因子的有效手段。STEP01基质制备将含有目标调控序列的特异DNA片段进行生物素标记，与链亲和素包被的磁珠（如DynalbeadsM-280）偶联制备亲和基质。BIOTIN-STREPTAVIDINSTEP02特异性结合将细胞核提取物与DNA-磁珠复合物孵育，DNA结合蛋白通过特异性识别与磁珠上的DNA序列结合。NUCLEAREXTRACTSTEP03洗涤与洗脱低盐洗涤去除非特异吸附蛋白后，用高盐缓冲液或过量竞争DNA将特异结合的转录因子洗脱释放。HIGHSALTELUTIONSTEP04鉴定与克隆洗脱蛋白经SDS分离后，通过质谱（MS）分析鉴定蛋白身份，进而克隆编码该蛋白的基因。SDS/MSMolecularBiology·DNA-ProteinInteractionEMSA（凝胶阻滞实验）EMSA基于蛋白质结合DNA后复合物迁移速率减慢的原理，在非变性凝胶中直观显示DNA-蛋白质相互作用，通过竞争实验和超迁移实验验证特异性。EMSA凝胶放射自显影：游离探针（下方）与蛋白-DNA复合物（上方）01探针标记与孵育—放射性或荧光标记的DNA探针与纯化蛋白或核提取物孵育后，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。02迁移阻滞—蛋白-DNA复合物分子量大且电荷改变，迁移速率明显减慢，在凝胶上表现为条带"上移"（shiftband）。03竞争验证—加入100倍过量未标记竞争DNA（coldprobe）可消除shiftband，证明结合具有序列特异性。04抗体超迁移—加入特异性抗体后复合物进一步增大，条带更加上移（supershift），可确认参与结合的蛋白身份。MOLECULARBIOLOGYDNaseI足迹法（Footprinting）DNaseI足迹法通过比较蛋白质保护区域与对照的酶切图谱差异，精确定位蛋白质在DNA上的结合位点，可达单碱基分辨率。01将目标DNA片段一端用³²P标记，分为加蛋白组和不加蛋白对照组，两组分别用低浓度DNaseI处理³²P末端标记02DNaseI浓度控制为每条DNA链平均只被切割一次，产生从标记端到切割位点的一系列不同长度片段低浓度单次切割03蛋白结合区域受空间保护不被DNaseI切割，在变性测序胶上对应位置出现无条带的"空白区"即为足迹空白足迹区04将足迹区与同一片段的Maxam-Gilbert或Sanger测序条带对比，可精确确定蛋白结合位点的碱基坐标单碱基分辨率MolecularBiology·EpigeneticsChIP与ChIP-seq技术染色质免疫沉淀（ChIP）通过甲醛交联在体内"冻结"蛋白质-DNA互作状态，利用特异性抗体免疫沉淀目标蛋白及其结合的DNA片段，是研究体内转录因子占位和组蛋白修饰的金标准技术。甲醛交联用1%甲醛处理活细胞，在蛋白质与DNA之间形成共价交联，原位固定真实的互作状态，确保捕获瞬时结合的蛋白-DNA复合物。1%HCHO染色质片段化超声处理将交联后的染色质随机打碎为200–500bp片段，确保每个片段含单个蛋白结合事件，便于后续特异性富集。200–500bp免疫沉淀用目标蛋白特异性抗体偶联磁珠富集蛋白-DNA复合物，通过多轮洗涤去除非特异结合的染色质片段，提高信噪比。Ab+Beads解交联与分析65°C过夜逆转交联释放DNA，纯化后通过qPCR验证特异位点，或构建文库进行高通量测序实现全基因组定位。65°C/ChIP-seqCHAPTER04蛋白质-蛋白质相互作用研究技术TechniquesforStudyingProtein-ProteinInteractionPROTEININTERACTION免疫共沉淀（Co-IP）利用特异性抗体免疫沉淀"诱饵蛋白"，检测天然复合物中"猎物蛋白"是否共同沉淀，验证蛋白体内相互作用。01细胞裂解使用温和的非变性裂解液处理细胞或组织样品，保持蛋白质天然构象和蛋白质-蛋白质互作复合物的完整性，避免强变性剂破坏相互作用02免疫沉淀加入针对诱饵蛋白（bait）的特异性抗体，与裂解液中的目标蛋白结合后，再加入ProteinA/G磁珠捕获抗体-蛋白复合物，实现特异性富集03共沉淀检测充分洗涤去除非特异性结合后，进行SDS电泳分离沉淀物，WesternBlot使用猎物蛋白（prey）抗体检测其是否被共沉淀下来04对照设置设置IgG同型对照排除磁珠和抗体Fc段的非特异性吸附，设置input对照确认裂解液中两种目标蛋白均存在且具有表达MolecularBiology酵母双杂交系统（Y2H）酵母双杂交系统利用真核转