CN119410754A 基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA检测方法 （浙江大学）

基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA本发明公开了一种基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA检测方法。本发明方法为将待检测的含靶标circRNA的样品与特异性逆转录引靶标circRNA的含量；所述gDNA的核苷酸序列与circRNA逆转录得到的cDNA序列特异性互补，所述DNA核酸探针序列与cDNA被pfAgo一次切割后的序列特异性互补，所述DNA核酸探针为带有荧光标记的单链DNA探针。本发明可以实现hsa_2物对待测样品中的靶标circRNA进行逆转录滚环扩增，得到具有多组重复序列的长单链2)向步骤1)所得体系中加入pfAgo蛋白、gDNA和D2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，待检测的靶标circRNA为hsa_circ_0001445或hsa_circ_0005.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，当靶标circRNA为hsa_circ_0001445和hsa_circ_0001141时，步骤1)中的特异性逆转录引物包括等比例的序列SEQIDNO.5所示引物和序列SEQIDNO.6所示引物；步骤2)中的gDNA包括等比例的序列SEQIDNO.7所示8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，检测hsa_circ9.一种基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA多的靶标circRNA为hsa_circ_00014所述特异性逆转录引物包括等比例的序列SEQIDNO.5所示引物和序列SEQIDNO.6所示引物；所述gDNA包括等比例的序列SEQIDNO.7所示gDNA和序列SEQIDNO.8所示gDNA；所述DNA核酸探针包括等比例的序列SEQIDNO.9所示DNA核酸探针和序列SEQID3[0001]本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种基于Argonaute蛋白和滚环扩增的病和癌症等疾病的潜在诊断及预后生物标志物。例如，hsa_circ_0001445和hsa_circ_于RT_qPCR基于反向剪接位点(back_splicingjunction,BSJ)，该方法无法区分反式剪接号放大技术开发了各种circRNA检测新策略，例如滚环扩增(Rollingcircleamplification,RCA)、环介导的等温扩增(Loop_mediatedisothermalamplification,DSN的circRNA检测方法可以直接获得放大的荧光信号，但不能在没有RNaseR处理的情况[0004]成簇的规律间隔短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR_as或前间隔序列侧翼位点(protospacerflankingsequence,PFS)序列限制；难以实现多重4实现多重靶标同时分析的circRNA检测方法，以应用于hsa_circ_0001445和hsa_circ_[0006]为解决现有技术中的问题，本发明提出了一种基于Argonaute蛋白和滚环扩增的[0008]本发明提供的基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA检测方法，包括如下步录引物对待测样品中的靶标circRNA进行逆转录滚环扩增，得到具有多组重复序列的长单反应混合液的荧光信号计算所述靶标circRNA的含量；其中，所述gDNA的核苷酸序列与circRNA逆转录得到的cDNA序列特异性互补，所述DNA核酸探针序列与cDNA被pfAgo蛋白一检测的靶标circRNA为hsa_circ_0001445和hsa_circ_[0015]所述特异性逆转录引物包括等比例的序列SEQIDNO.5所示引物和序列SEQIDgDNA；所述DNA核酸探针包括等比例的序列SEQIDNO.9所示DNA核酸探针和序列SEQID构建了一种能够用于多重circRNA检测的新方法。滚环扩增的应用一方面放大了检测信号提高检测灵敏度，一方面排除了线性RNA的干扰；Argonaute蛋白的应用通过特异性识别5circRNA滚环扩增产物中的重复序列能够进一步确保检测的特异性并能够实现一锅多重靶标检测。因此，本发明提供的circRNA检测方法实现了高灵敏、高特异以及hsa_circ_hsa_circ_0001445和hsa_circ_0001141结果图，B图为实时定量逆转录PCR检测hsa_circ_0001445和hsa_circ_000容的示范且不圈定限制范围。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提在gDNA指导下能够被激活并切割cDNA产生大量5'磷酸化的ssDNA，这些ssDNA可以作为列特异性互补带荧光标记的DNA核酸探针，pfAgo的第二次切割导致DNA核酸探针荧光基团以通过使用不同荧光标记的DNA核酸探针实现对circRNA的多重检测。本发明基于Argonaute蛋白和滚环扩增的circRNA检测方法原理示意图如图序列与circRNA逆转录得到的cDNA序列特异性互补，所述DNA核酸探针序列与cDNA被pfAgo6[0029]本发明待检测的靶标circRNA为hsa_circ_0001445或hsa_circ_0001141中的一种在实施例1_3中，采用人工合成的包含hsa_circ_0001445或hsa_circ_0001141反向剪切位[0032]当靶标circRNA仅为hsa_circ_0001445时，步骤1)中的特异性逆转录引物的序列[0033]当靶标circRNA为hsa_circ_0001445和hsa_circ_0001141时，则同时包含上述的7[0036]利用逆转录滚环扩增结合pfAgo切割同时检测hsa_circ_0001445和hsa_circ_[0037]逆转录滚环扩增反应：使用HiScriptⅢ1stStrandcDNASynthesisKit(+gDNAwiper)试剂盒进行操作：将circRNA1445和circRNA1141各2.5μl和1μl10×RTMix，1μlEnzymeMix，20μM逆转录引物RT1445和RT1141各0[0038]pfAgo酶切反应：取上述反应得到的混合液2μl，与2μl10×pfAgoreactionRNase_freewater混合后在95℃下反应30min。[0039]为考察本方法对circRNA多重检测的可行性，设计了5组实验进行验证，所用circRNA1445和circRNA1141浓度为500nM。设置第1组为不加circRNA1445和circRNA1141，来替换circRNA1445和circRNA1141，逆转录滚环扩增和pfAgo酶切反应结束后测定荧光光8[0041]为考察本方法对circRNA多重检测的特异性，设计了7组实验进行验证，所用circRNA1445和circRNA1141浓度为500nM。设置第1组为不加circRNA1445和circRNA1141，第2组不加circRNA1141，第3组不加circRNA1445，第4组为正常实验组，第5组加入其他circRNA，第6组加入其他miRNA，第7组将circRNA替换为反应缓冲液，逆转录滚环扩增和pfAgo酶切反应结束后分别测定521nm和566nm处检测到的FAM和CY3荧光信号强度。结果如[0043]为确定本方法对circRNA多重检测的灵敏度，使circRNA1445和circRNA1141的终浓度为0_10nM，逆转录滚环扩增和pfAgo酶切反应结束后分别测定521nm和566nm处检测到于circRNA1445和circRNA1141的[0044]实施例1_3中以circRNA1445和circRNA1141为对象进行研究，由于其包含hsa_circ_0001445或hsa_circ_0001141反向剪切位点，实施例1_3的结果同样适用于实际靶标hsa_circ_0001445或hsa_circ_000[0046]为探讨本方法定量检测实际样本中circRNA的可行性，提取人正常肝细胞(LO2)、人肝癌细胞(Hep3B)中的1_5ugRNA样本，分别使用本发明检测方法以及实时定量逆转录显示，本发明检测方法检测的hsa_c