CN119410757A 环状dna的扩增方法 （莫德纳酶学有限公司）

201580063334.62015.11.18本发明提供可在无细胞系统中简便并且指制起始序列(originofchromosome(oriC))的环状DNA与含与以下的酶组的反应液混合而生成制的第一酶组；(2)催化冈崎片段连接反应而合(3)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶2有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single_strandbindingprotein(b)催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组，其包括(c)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组，其含选自下列的酶：有拓扑异构酶在20℃~80℃的等温条件下保温上述反应混合物而扩增上述环状DNA的工序，2.权利要求1所述的方法，其中上述第三酶组6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中在形成上7.权利要求1～6之任一项所述的方法，其中在20℃~50℃的等温条件下保温上述反应8.权利要求1～7之任一项所述的方法，其中在25℃~50℃的等温条件下保温上述反应有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single_strandbindingprotein(b)催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组，其包括3有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single_strandbindingprotein(b)催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组，其包括(c)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组，其含选自下列的酶：有拓扑异构酶4[0003]成为生物技术发展的基盘的DNA克隆技术是将由DNA片段的环化调制的环状DNA在告有使用大肠杆菌来源的纯化酶组而再构成大肠杆菌的小染色体的复制(非专利文献3)，5[0019]本发明旨在提供可在无细胞系统中简便并且指数扩增环状DNA、特别是长链环状[0021]本发明人等为解决上述课题重复锐意研究的结果发现，通过使有复制起始序列(originofchromosome(oriC))的环状DNA与含以下的酶组的反应液混合而生成的反应混[0025]“复制的开始(DNA双键断裂)·延伸(复制叉进行)·复制的姊妹DNA的分离[0038]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0041][2]所述的方法，其中能与有DnaA活性的酶结合的复制起始序列是大肠杆菌的复6[0047][2]～[5]之任一项所述的方法，其中有DNA促[0051][2]～[7]之任一项所述的[0057][2]～[10]之任一项所述的方法，其中有DNA聚合酶III活性的酶或酶组是DnaX、DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single_strandbindingprotein7[0072]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0082]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0089]【图4】图4显示对以200kb及80kb的长链环状DNA作为模板使用时的扩增产物进行模板使用时的每反应时间的增副产物的结果。图4b显示以80kb(15pM,8ng)及200kb(5pM,6.7ng)的长链环状DNA作为模板使用时的反应3小时后的增副产物[0090]【图5】图5显示对以由使用GibsonAssembly法在试管内连接环状化的DNA作为模8结果。图6a显示对以9.6kb的环状DNA作为模板使用时的扩增产物进行琼脂糖电泳，由种环状DNA的混合物在1个试管内作为模[0101]在每1反应中使用的模板DNA的量无特别限制，也可以每1反应1分子的环状DNA作9[0105]本发明涉及使有复制起始序列(originofchromosome(oriC))的环状DNA与含以[0111]作为催化环状DNA的复制的第一酶组，可使用例如KaguniJM&Kornberg始物活性的酶，其生物学来源就无特别限制，可适宜地使用例如大肠杆菌来源的DnaA。[0114]拟核蛋白质是指拟核中所含的蛋白质。在本发明中使用的1种以上的拟核蛋白质[0116]作为单链DNA结合蛋白质(single_strandbindingprotein(SSB))，只要是与大[0118]作为有DNA解螺旋酶装载体活性的酶，只要是与大肠杆菌的DnaC有同样的活性的[0123]在本发明中，形成连环体的2个姊妹环状DNA是指由DNA复制反应合成的2个环状[0127]作为有DNA聚合酶I活性的酶，只要是与大肠杆菌的DNA聚[0139]也可使含上述酶的无细胞蛋白质表达系统的反应液直接与成为模板的环状DNA混[0140]无细胞蛋白质表达系统可以含由与编码上述酶的基因的碱基序列互补的序列构也可以编码各酶的基因或含编码各酶的基因的表达载体等作为模板DNA的无细胞转录翻译[0142]本发明的方法包括形成含上述第一至第三酶组的反应液和成为模板的环状DNA的[0144]本发明的方法还包括在等温条件下保温上述反应混合物20～80℃的范围的一定的温度，可设为25℃~50℃所含的范围的一定的温度，可设为[0146]使用本发明的方法扩增的环状DNA可在转化等的其后的目的中使用直接或者适宜化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；及催化2个姊妹环妹环状DNA的分离反应的第三酶组。本发明的试剂盒可为含将上述酶的混合物包装为1个个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组的各酶的无示大肠杆菌来源DNA连接酶、PolI表示大肠杆菌来源DNA聚合酶I、GyrA表示大肠杆菌来源GyrA、GyrB表示大肠杆菌来源GyrB、TopoIV表示大肠杆菌来源ParC及ParE的组合，Topo[0160]SSB是从SSB的表达大肠杆菌的株，用含硫酸铵沉淀及离子交换柱层析的工序纯[0161]IHF是从IhfA及IhfB的共表达大肠杆菌的株，用含硫酸铵沉淀及亲和性柱层析的[0167]GyrA,GyrB是从GyrA的表达大肠杆菌的株和GyrB的表达大肠杆菌的株的混合物，[0168]TopoIV是从ParC的表达大肠杆菌的株和ParE的表达大肠杆菌的株的混合物，用素抗性盒和在大肠杆菌染色体之中含oriC的区域的期望的长度序列oriC和卡那霉素抗性(Km)的PCR片段(2.3kb)与有dnaA基因及dnaN基因序列的PCR片段两端的20碱基的相同序列(记作H1,H2)连接成为环状结构。反应通过向GibsonAssembly9_+2SybrGreen(宝生物株式会社)染色，检测扩增[0202]从实施例1中记载的9.6kb的环状DNA及12.0kb的环状DNA(具有复制起始序列oriC盒和大肠杆菌染色体的一部分的区域的期望的长度的环状D[0204]通过将上述2种环状DNA的混合物稀释至在反应(Km)的双链DNA片段(4.6kb)及含lacZ(β_半乳糖苷酶)基因的双链DNA片段(3.4kb)连接而1μl其添加到新的扩增反应液，同样地反应而作为下一传代扩增。将此传代扩增重复至10[0209]结果得知，在10次传代后仍有效进行环状DNA的扩增。如实施例2(图7)的结果所[0211]由于在实施例4中的模板的环状DNA中含lacZ基因，如果在X_gal板上培养用此环状基因转化的大肠杆菌，则正常表达lacZ基因的集落(lacZ+)由于可分解X_gal而呈蓝色，由复制错误的变异导入而lacZ基因变得无法正常发挥功能的集落(lacZ_)由于无法分解X_____1250.1[0226]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0228]3.实施方式2所述的方法，其中能与有Dn杆菌的复制起始序列。[0230]5.实施方式2～4之任一项所述的方法，其中1种以[0231]6.实施方式2～5之任一项所述的方法，其中有[0232]7.实施方式2～6之任一项所[0233]8.实施方式2～7之任一项所述的方法，其中有DNA解螺旋酶装载体活性的酶是白质、有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single_strandbinding[0238]13.实施方式1～12之任一项所述的方法，其[0239]14.实施方式1～13之任一项所述的方法，其中在工序[0246]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0254]催化冈崎片段连接反应而合成形成连环体的2个姊妹环状DNA的第二酶组是有RNA[0257]1.重复复制循环而指数扩增环状DN