(2.5.1)-石蜡切片染色技术病理检验技术

石蜡切片染色技术白细胞？白细胞比较下面两图后，讨论：染色的意义？第一节概述一、染色的概念

用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于显微镜观察和分析的方法，称为染色。

二、染色的目的

组织经过染色后，由于不同的组织成分对染色剂的作用呈现出不同的颜色，产生不同的折射率，使组织和细胞中各种成分在光学显微镜下的分辨率得以提高。三、染色剂(一)一般性质

染色剂又称染料，是指分子中含有一个或一个以上的发色团和一个或一个以上的助色团的无机或有机化合物。1．发色团

是指能使染料产生颜色的基团。2．助色团能使发色团产生电离成为盐类，加深染料分子的颜色，并与被染物质分子间形成亲和力的基团，称为助色团。注意

只有发色团而无助色团的化合物，因其对组织和细胞无亲和力，不能使组织和细胞着色，故不能称为染料。第二节常规染色技术

最常用的染色方法，故称为常规染色或普通染色，简称HE染色。一、苏木素染色原理磷酸电离：H3PO4==H2PO4-+H+苏木素为碱性染料，带正电荷，易于与带负电荷的细胞核结合。二、苏木素染色的条件1、氧化形成苏木红(成熟)（1）氧化汞（2）空气、阳光暴露2、媒染剂

硫酸铝钾等。思考与讨论在配置苏木素溶液中氧化汞和硫酸铝钾各起什么作用？

媒染剂

对染料和组织都有亲和力并与染料和组织结合在一起，促进染色的试剂，称之为媒染剂。常用的媒染剂多为过渡金属元素、一至三价的可溶性盐类或氢氧化物，如硫酸铝钾、磷钼酸、铬盐、磷钨酸等。

三、伊红染色原理等电点：pH4.7-5.0伊红是酸性染料，电离后形成带负电荷的阴离子，易与胞质中带正电荷的蛋白质结合。在伊红溶液中加入醋酸起什么作用？思考与讨论

促染剂促使染料对组织着色，增强染料的染色能力，自身不参加染色反应的物质，称为促染剂，如伊红染液中的冰醋酸。

使用时促染剂的量不宜过多，如伊红染液内过多加入冰醋酸，会造成色调不正，切片易褪色，难以长期保存。二、染色过程

染色前处理（一）脱蜡至水石蜡切片在进行染色之前，必须先用二甲苯脱去切片中的石蜡，使染色剂易于进入组织、细胞。然后用无水乙醇洗脱用于脱蜡的二甲苯，便于水进入组织、细胞。在脱蜡和乙醇洗涤后，用水洗切片，当水进入切片后，苏木素染液才能浸入细胞核，使细胞核染色。思考与讨论为什么苏木素染色前要进行“脱蜡至水”的操作？提示：苏木素是水溶性染料。（二）脱甲醛色素在切片脱蜡至水后，先用Verocay液（1%氢氧化钾水溶液1ml，80%乙醇99ml）处理10min，再用流水冲洗5min，方可常规染色。二、染色后处理1.分化作用

1%盐酸乙醇分化液脱去胞核中结合过多的染料和胞质中吸附的染料，以保证胞核、胞质染色的分明。注意：不可过度分化。

2.蓝化作用

分化之后用水洗去切片中的酸，终止分化，再用弱碱性水浸洗切片，使苏木素染上的细胞核变成蓝色。一般用自来水浸洗即可，也可用稀氨水（1%氨水）或温水浸洗。3.染色后的脱水

由低浓度向高浓度（80%、90%、95%、100%）逐渐过渡，以彻底脱去组织中的水分，为二甲苯进入细胞创造条件。4.染色后的透明

一般选用二甲苯作透明剂。

可提高切片的透明度，以利于光线的透过。5.溶液的更换

染色后脱水透明用的各级乙醇及二甲苯，应定期更换。应养成记录使用期限、次数及大约染片数量的工作习惯。溶液更换方法

将最低浓度乙醇及二甲苯Ⅰ废弃，将无水乙醇Ⅱ及二甲苯Ⅱ更换成新液，其余各级乙醇及二甲苯依次降级替补使用。三、封固

为了便于诊断和长期保存，组织切片必须用盖玻片进行封固。封固的主要作用是：①避免直接与空气接触，而发生氧化褪色；②折光率与玻片的折光率相似，以获得清晰的镜检效果。（一）封固剂常用的封固剂可分为两类。1.含水封固剂常用的甘油、甘油明胶等。难以长期保存。2.无水封固剂又称油溶性封固剂，如中性树胶、人工树胶等。中性树胶

一种优良的最常使用的封固剂。保存：有色玻璃瓶内，并放置在黑暗处。缺点：切片放置过久后会变暗，有时碱性染色剂也会褪色。（二）封固方法

无水封固剂封固，见视频演示。四、H-E染色石蜡切片质量标准优质标准满分/分质量缺陷减分组织切面完整，内镜咬检、穿

刺标本切面数10组织稍不完整：减1～3分；不完整：减4～10分；

未达到规定面数：减5分切片薄（3～5um），厚薄均匀10切片厚（细胞重叠），影响诊断：减6～10分；厚薄

不均匀：减3～5分切片无刀痕、裂隙、颤痕10有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分；有

刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分切片平坦无皱褶、折叠10有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分；有皱褶

或折叠影响诊断：各减5分切片无污染物10有污染物：减10分无气泡（切片与载玻片间/盖

玻片与切片、载玻片间），盖玻片

周围无胶液外溢10有气泡：减3分；胶液外溢：减3分透明度好10透明度差：减1~3分；组织结构模糊：减5~7分细胞核与细胞质染色对比清晰10细胞核着色灰淡或过蓝：减5分；红（细胞质）与

蓝（细胞核）对比不清晰：减5分切片无松散，裱贴位置适当10切片松散：减5分；切片裱贴位置不当：减5分切片整洁，标签端正粘牢，编

号清晰10切片不整洁：减3分；标签粘贴不牢：减3分；编

号不清晰：减1分合计100第四节问题和注意事项一、问题及处理（一）固定液和切片类型的选择1.选择恰当固定液一般选用4%中性甲醛固定液。含汞固定液固定的组织，染色前需经脱汞处理。2.切片类型

在实际工作中，多数染色采用石蜡切片，但一些特殊染色和组织化学染色法则需选用冷冻切片。

（二）染液的配制1.根据用量和有效期确定染液的配制量用量大、有效期长的染色剂，可适当多配制一些备用。2.注意染液浓度和pH（三）染液的存放与更换1.存放染液应将配制好的染液装入有色玻璃瓶内，存放于低温、黑暗处。2.及时清洗染色用具3.定期过滤染液4.及时更新染液（四）染色时间的确定

应根据染液的浓度、使用时间的长短和染色对象的前期处理，以及染色时的环境温度等情况灵活掌握，不能一概而论。

实验：苏木素染液的配置一、关于苏木素二、材料及配置方法（Harris苏木素液）三、注意事项四、其他苏木素染液配方一、关于苏木素

要使苏木素具有强的染色力，必须具备两个条件：（一）产生有效成分苏木红，（二）加入媒染剂。

苏木红需经氧化才能获得，通常有两种方法：

一是天然成熟，苏木素与其它试剂混合好后，暴露于阳光或亮处，在自然光的作用下，慢慢地氧化成熟，一般需四周左右。

二是加入化学试剂促进成熟，如加入红色氧化汞或碘酸钠促使苏木素成熟。二、材料和方法（Harris苏木素液）[材料]

苏木素0.5g

无水乙醇5ml

硫酸铝钾8g

蒸馏水100ml

红色氧化汞0.5g【步骤】1、将苏木素完全溶于无水乙醇。2、将硫酸铝钾和蒸馏水放入三角烧瓶中加温搅拌至完全溶解时，再缓慢加入苏木素-乙醇溶液，用玻璃棒继续加热至紫红色（约2-5分钟）。3、关火，慢慢倾入红色氧化汞后，加热使溶液沸腾片刻（约2-3分钟），当染液呈紫色时，立即将染液置入冷水中，连续摇荡使之迅速冷却。4、正常室温下静置染液一夜，用滤纸过滤后即可使用，使用前每100ml染液加冰醋酸4ml。三、注意事项称取试剂氧化汞有剧毒！滤纸过滤注意①苏木素一定要预先溶解，否则较难彻底溶解。

②加入黄色氧化汞后，可产生大量的气泡，因此，配制500ml的溶液，一定要选择2000ml以上的容器，否则液体便会溢出。

③当溶液变为深紫色后，烧瓶应直接插入冰水中，主要目的是不让溶液过度氧化，以免缩短溶液的使用寿命。

④溶液过滤后方加入冰醋酸，不要颠倒过来。如果加入冰醋酸后再过滤，过滤速度将非常慢，这是因为醋酸会使滤纸中的纤维膨胀，增加了密度，使溶液不易通过，导致过滤时间延长。

⑤该苏木素在使用一段时间后，可以在表面产生金属膜。当出现这种现象时，可用粗滤纸捞去，否则贴于切片上将较难除去。

四、其他苏木素Gill改良苏木素液[材料]苏木素2g

无水乙醇250ml

硫酸铝钾17g

蒸馏水750ml

碘酸钠0.2g