中国实验动物护理和使用指南

中国实验动物护理和使用指南1范围本指南适用于在中国境内从事实验动物繁育、供应、使用的所有机构及相关人员，涵盖啮齿类（小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠）、兔类、非人灵长类、犬类、猪类、禽类等常用实验动物，以及斑马鱼、爪蟾、线虫等模式生物的护理与使用全流程管理，明确伦理审查、设施管理、饲养护理、动物实验、福利保障、质量控制、应急管理全环节的规范要求，为生命科学研究、药品检验、生物制品研发等活动提供标准化技术支撑。2规范性引用文件下列文件对于本指南的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本指南；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本指南。GB14922.1实验动物寄生虫学等级及监测GB14922.2实验动物微生物学等级及监测GB14923实验动物哺乳类实验动物的遗传质量控制GB14924实验动物配合饲料通用质量标准GB14925实验动物环境及设施GB/T35823实验动物动物实验通用要求《实验动物管理条例》（2017年修订）《动物伦理审查指南》（科技部2016年）《3R原则在动物实验中的应用指南》（中国实验动物学会2022年）3术语与定义3.1实验动物指经人工饲育，对其携带的微生物和寄生虫实行控制，遗传背景明确或者来源清楚，用于科学研究、教学、生产、检定以及其他科学实验的动物。3.23R原则指替代（Replacement）：尽可能使用非动物方法、低等生物或细胞模型替代活体动物实验；减少（Reduction）：在保证实验数据可靠的前提下，通过优化实验设计最大程度减少使用动物的数量；优化（Refinement）：优化实验操作和饲养流程，减少动物的疼痛、应激和伤害。3.3实验动物福利伦理审查委员会（IACUC）指由机构设立，由实验动物学、兽医学、生物学、法学、伦理学等领域专业人员及公众代表组成，负责本机构实验动物福利伦理审查、监督的专门组织。3.4屏障环境指符合实验动物栖息要求，通过空气净化、人员/物品/动物流动控制等措施，严格控制微生物和寄生虫侵入，用于饲养清洁级、无特定病原体级（SPF级）实验动物的独立设施区域。4机构与人员管理4.1机构资质要求从事实验动物繁育、使用的机构必须取得省级及以上科技行政主管部门颁发的《实验动物生产许可证》或《实验动物使用许可证》，许可证有效期为5年，到期前6个月需提交复审申请。涉及非人灵长类、犬类等重点保护动物实验的机构，需同时取得林业和草原行政主管部门核发的野生动物人工繁育许可、动物防疫条件合格证。机构需设立独立的IACUC，成员不少于5人，其中至少包含1名不隶属于本机构的外部伦理专家，公众代表占比不低于15%，所有成员需经过中国实验动物学会或省级实验动物协会组织的福利伦理培训并取得合格证书。IACUC每年至少开展4次现场监督检查，对所有动物实验项目进行全周期跟踪评估。4.2人员资质与培训所有直接接触实验动物的从业人员必须取得省级实验动物主管部门颁发的《实验动物从业人员岗位证书》，每年参加继续教育培训不少于16学时。从事非人灵长类操作、动物手术、病原感染类实验的人员需额外接受专项技能培训，经考核合格后方可独立开展工作。机构需为从业人员配备符合生物安全要求的个人防护装备（PPE），每年组织1次职业健康检查，建立从业人员健康档案：对患有人畜共患病、过敏性疾病且不适宜接触实验动物的人员，需及时调整岗位。人员进入屏障环境需严格执行“二次更衣”流程：第一更衣区更换个人衣物，佩戴一次性帽子、口罩，洗手消毒后进入第二更衣区，穿戴灭菌工作服、鞋套、手套，经风淋30秒后方可进入饲养区域，操作过程中手套破损需立即更换并进行消毒。5伦理审查与3R原则落实5.1伦理审查流程所有动物实验项目必须提前提交IACUC审查，提交材料需包含：项目背景与研究目的、实验动物种类/品系/等级/数量、饲养管理方案、实验操作流程、疼痛/应激评估及缓解措施、动物处死方法、3R原则落实方案、操作人员资质证明等内容。IACUC对项目采用“主审+集体评议”机制，审查要点包括：研究目的是否具有科学必要性、动物使用数量是否符合统计学最小样本量要求、实验操作是否会给动物带来超出合理范围的疼痛、替代方案是否已被充分评估。涉及疼痛等级为中度及以上的实验项目，需组织外部专家论证，审查通过后方可立项。实验周期超过1年的项目，需每年向IACUC提交年度进展报告，发生实验方案调整、动物意外死亡数量超过预期10%等情况时，需在24小时内提交变更申请，经重新审查通过后方可继续实施。5.23R原则实施要求替代方面：鼓励优先采用细胞培养、类器官、器官芯片、计算机模拟等非动物方法开展实验。在毒理学评价领域，除法规强制要求的体内实验外，需首先完成体外细胞毒性、3D皮肤模型等替代实验，数据可支撑研究结论的不得开展动物实验；使用低等生物的实验要求：能用斑马鱼完成的实验不得使用啮齿类动物，能用啮齿类完成的实验不得使用非人灵长类动物。减少方面：动物样本量需通过统计学方法计算确定，同一机构内不同项目之间可共享动物组织、脏器等实验材料，不得因“预留样本”“预实验备用”等理由超额申请动物数量。实验过程中需优化检测技术，采用微量采血、活体成像等方法减少单只动物的使用次数，每只动物的重复实验操作不得超过方案规定的上限。优化方面：所有可能引起动物疼痛的操作（如手术、注射、采血、肿瘤接种）需采取镇痛措施：对轻度疼痛操作（如皮下注射、尾静脉采血）采用局部麻醉，对中度及以上疼痛操作（如开腹手术、骨折造模）采用“局部麻醉+全身镇痛”联合方案，镇痛药物的选择和剂量需符合兽医药典要求，不得为简化操作省略镇痛步骤。动物实验结束后需采用人道终点判定方法，当动物出现体重下降超过20%、无法进食饮水、重度疼痛无法缓解等情况时，需及时对动物实施安乐死，避免不必要的痛苦。6设施与环境管理6.1设施分类与建设要求实验动物设施分为普通环境、屏障环境、隔离环境三类，不同等级动物需饲养在对应等级的设施中：普通环境：符合动物基本栖息要求，适用于饲养普通级大动物（犬、猪、猴等），环境参数需满足：温度18~29℃（根据动物种类调整，非人灵长类20~26℃，犬18~24℃），相对湿度40%~70%，日温差≤4℃，换气次数≥8次/小时，噪声≤60dB，照度150~300lx，每天光照12小时/黑暗12小时循环。屏障环境：适用于饲养清洁级、SPF级啮齿类、兔类，空气洁净度达到万级，送风经过三级过滤（初效+中效+高效），高效过滤器的检漏周期为6个月，环境参数需满足：温度20~26℃，相对湿度40%~70%，日温差≤3℃，换气次数10~20次/小时，动物饲养区与外界保持10~20Pa的正压，不同功能区之间的压力梯度差≥5Pa，噪声≤60dB，照度100~200lx，明暗循环可根据实验需求调整，最长不超过14小时光照/10小时黑暗。隔离环境：适用于饲养无菌级、悉生级实验动物，以及开展高致病性病原感染类动物实验，空气洁净度达到百级，采用隔离器饲养，内部保持正压（感染实验采用负压隔离器），所有进入隔离器的物品需经过灭菌处理，操作过程中严格遵守生物安全要求。设施内需设置独立的动物接收区、检疫区、饲养区、实验操作区、废弃物处理区、动物尸体暂存区，各区域物理隔离，避免交叉污染。动物尸体暂存区配备-20℃以下的专用冷藏设备，设置明显的生物安全标识。6.2设施日常维护与监测设施运行过程中需安排专人24小时值守，对环境参数进行实时监测，温湿度、压力、换气次数等数据每小时记录1次，记录保存期限不少于5年。屏障环境的高效过滤器每年更换1次，初效、中效过滤器每1~3个月更换1次，更换后需对空气洁净度进行检测，合格后方可继续使用。每月对设施环境进行微生物监测：普通环境每月检测1次菌落总数，不得超过1000CFU/m³；屏障环境每两周检测1次空气落下菌数，饲养区平板暴露30分钟后菌落数不得超过3个/皿；隔离环境每周检测1次，不得检出菌落。设施内的所有笼具、饮水瓶、垫料等物品需经过灭菌处理：高压灭菌参数为121℃、0.1MPa，维持20~30分钟，灭菌后的物品需粘贴灭菌标识，标注灭菌日期和有效期，有效期为7天。进入屏障环境的小型物品可采用过氧乙酸熏蒸、环氧乙烷灭菌等方式处理，液体药品需经过0.22μm滤膜过滤除菌。7实验动物饲养与护理7.1动物引种与检疫实验动物必须从具有《实验动物生产许可证》的单位购买，引种时需索要同批次动物的质量合格证明，包含遗传背景、微生物/寄生虫检测报告、饲料营养成分报告等内容，不得从无资质单位购买动物，不得使用野生动物作为实验动物（特殊物种需经省级以上科技主管部门批准）。新引入的动物必须经过检疫期：啮齿类动物检疫期为3~7天，兔类、犬类为7~14天，非人灵长类为30~45天。检疫期间单独饲养，每天观察动物的饮食、活动、粪便情况，按照GB14922的要求进行微生物、寄生虫抽检，发现异常动物及时隔离，确诊患病的动物全部予以淘汰，不得进入饲养区或用于实验。7.2饲养密度与笼具要求不同种类动物的饲养密度需符合以下要求，避免因空间不足导致动物应激、争斗：小鼠：单笼饲养数量≤5只/标准笼（300mm×200mm×150mm），怀孕母鼠、哺乳期母鼠单笼饲养，每笼最多带仔10只。大鼠：单笼饲养数量≤3只/标准笼（450mm×300mm×200mm），体重超过300g的大鼠单笼饲养。豚鼠：单笼饲养数量≤2只/标准笼（500mm×350mm×250mm），怀孕母鼠单笼饲养。兔：单笼饲养，笼具尺寸不小于600mm×500mm×400mm，大型兔笼具尺寸不小于800mm×600mm×500mm。犬：小型犬（体重≤10kg）单笼饲养笼具不小于1000mm×800mm×800mm，大型犬笼具不小于1200mm×1000mm×1000mm，每天至少进行1小时的户外活动。非人灵长类：单笼饲养笼具尺寸不小于700mm×700mm×800mm，群养猴舍每只动物的活动空间不小于3m³，配备爬架、玩具等enrichment（丰容）设施。笼具需定期清洗消毒：普通环境笼具每周清洗1次，每两周消毒1次；屏障环境笼具每周更换灭菌笼具1次，换下的笼具经过清洗、高压灭菌后重复使用。7.3饲料与饮水管理实验动物饲料必须符合GB14924的要求，不同等级、不同种类的动物使用对应等级的饲料：普通级动物使用普通配合饲料，SPF级动物使用Co⁶⁰辐照灭菌饲料（辐照剂量25~30kGy），无菌级动物使用高压灭菌或辐照灭菌的无菌饲料。饲料需储存在通风、干燥、阴凉的专用仓库，储存温度≤25℃，相对湿度≤60%，不得与有毒有害物品混放，饲料的保质期：粉状饲料为3个月，颗粒饲料为6个月，灭菌饲料为3个月，超过保质期的饲料不得使用。每周检查饲料储存情况，发现发霉、变质、虫蛀的饲料及时销毁。饮水要求：普通级动物使用自来水或纯化水，每周更换饮水2~3次；SPF级动物使用灭菌纯化水或高压灭菌饮水，每周更换灭菌饮水瓶2次；无菌级动物使用无菌饮水，每天更换。每月对饮水进行微生物检测，SPF级动物饮水中菌落总数不得超过10CFU/mL，不得检出大肠杆菌、沙门氏菌等致病菌。对于特殊实验需求的动物，如糖尿病模型、代谢病模型，需根据实验要求配制特殊饲料，饲料的营养成分需经过检测确认，符合实验方案要求后方可使用。7.4日常护理与健康监测饲养人员每天至少对动物进行2次健康巡查，观察内容包括：精神状态、被毛情况、饮食量、饮水量、粪便性状、活动情况、笼具内是否有外伤、死亡动物等，填写《饲养日志》，发现异常情况立即报告兽医和IACUC。兽医每周至少对饲养区进行1次巡查，每季度对所有动物进行1次健康抽检，抽检比例不低于饲养总量的1%，抽检内容包括：体重测量、体温检测、粪便寄生虫检测、血清抗体检测等。发现动物患病时，需立即隔离患病动物，明确诊断后采取治疗措施：对患有烈性传染病、人畜共患病的动物，需立即实施安乐死，对同批次动物进行全部检测，对饲养区域进行彻底消毒，同时上报省级实验动物主管部门和动物防疫部门。非人灵长类、犬类等高等动物需制定丰容方案：非人灵长类提供水果、坚果等食物丰容，配备秋千、镜子、益智玩具等环境丰容；犬类每天进行遛放、互动，定期提供咀嚼玩具，减少动物的刻板行为和应激反应。8动物实验操作规范8.1通用操作要求所有实验操作需在专门的实验操作区内进行，不得在饲养区开展实验。操作人员需提前熟悉操作流程，动作轻柔，避免粗暴操作导致动物应激或受伤。涉及挥发性麻醉剂、有毒有害试剂、放射性物质的操作，需在通风橱内进行，配备对应的防护设备，避免实验人员受到伤害，同时防止有害物质污染环境。同一间操作室不得同时开展不同生物安全等级的实验，不得同时操作不同品种、不同处理组的动物，避免交叉污染。实验结束后及时清理操作台面，采用75%酒精、0.1%新洁尔灭或过氧乙酸溶液进行消毒，使用过的器械及时清洗、灭菌。8.2常见操作规范8.2.1麻醉与镇痛动物麻醉前需禁食8~12小时（啮齿类禁食4~6小时，不禁水），根据动物种类和实验时长选择合适的麻醉方式：吸入麻醉：常用异氟烷、七氟烷，适用于中小动物的短时间麻醉，诱导浓度2%~4%，维持浓度1%~2%，麻醉过程中需监测呼吸频率、心率、血氧饱和度，避免麻醉过深导致动物死亡。注射麻醉：大鼠、小鼠常用戊巴比妥钠（30~50mg/kg腹腔注射）、水合氯醛（300~400mg/kg腹腔注射），兔常用戊巴比妥钠（30mg/kg耳缘静脉注射），犬、猴常用舒泰联合氯胺酮麻醉，注射麻醉前需准确称量动物体重，计算麻醉剂量，避免过量。术后镇痛：手术结束后根据疼痛等级给予镇痛药物，啮齿类常用美洛昔康（1~2mg/kg皮下注射，每24小时1次，连用2~3天），大型动物常用丁丙诺啡（0.01~0.05mg/kg肌肉注射，每12小时1次，连用3~5天），镇痛期间观察动物的饮食、活动情况，调整镇痛方案。8.2.2采血与给药采血操作需严格控制采血量，避免过量采血导致动物贫血或死亡：单次采血量不得超过动物总血量的10%，总血量按体重的6%~8%计算，两次采血间隔不少于2周。常见采血方法：小鼠尾静脉采血单次最大量0.2mL，眼眶静脉丛采血单次最大量0.5mL，心脏采血单次最大量1mL（仅适用于安乐死前采血）；大鼠尾静脉采血单次最大量0.5mL，眼眶静脉丛采血单次最大量2mL，心脏采血单次最大量5mL；兔耳缘静脉采血单次最大量10mL，心脏采血单次最大量50mL。给药操作需根据药物性质选择合适的给药途径，控制给药剂量：小鼠灌胃给药单次最大量0.5mL/10g体重，腹腔注射单次最大量1mL/10g体重，静脉注射单次最大量0.2mL/10g体重；大鼠灌胃给药单次最大量1mL/100g体重，腹腔注射单次最大量2mL/100g体重，静脉注射单次最大量0.5mL/100g体重。给药过程中避免药物渗漏导致局部组织坏死。8.2.3手术操作动物手术需在无菌环境下进行，所有手术器械需经过高压灭菌，操作人员穿戴无菌手术衣、无菌手套，动物手术部位进行备皮、消毒（采用碘伏或75%酒精消毒，消毒范围大于手术切口10cm），铺无菌洞巾。手术过程中动作轻柔，减少组织损伤，出血点及时止血，避免动物失血性休克。手术切口采用分层缝合，术后做好抗感染处理，连续3~5天注射抗生素。术后每天观察伤口愈合情况，有无红肿、渗液、感染等情况，7~14天根据愈合情况拆线。手术过程中安排专人监测动物的生命体征，出现呼吸抑制、心率下降等情况及时采取抢救措施，实验结束后不需要保留的动物可在麻醉状态下实施安乐死，需要后续观察的动物安置在单独的恢复笼中，待完全清醒后放回饲养区。8.2.4安乐死动物实验结束后需采用人道的安乐死方法，尽可能减少动物的痛苦，安乐死方法需经过IACUC批准。常用安乐死方法：啮齿类动物：优先采用二氧化碳窒息法（二氧化碳浓度缓慢升至100%，维持5~10分钟，确认动物呼吸停止、瞳孔散大、心跳停止后，再延长2分钟处理），也可采用颈椎脱臼法（需经过专业培训，操作熟练，避免动物痛苦）。兔类、犬类：采用过量麻醉剂静脉注射法，戊巴比妥钠剂量为正常麻醉剂量的3~5倍，确认动物死亡后再进行处理。非人灵长类：采用过量麻醉剂注射联合放血法，确保动物无痛苦死亡。怀孕动物、新生动物：采用二氧化碳窒息联合颈椎脱臼法，避免新生动物复苏。实施安乐死的人员需经过专业培训，操作完成后需由第二人确认动物死亡，动物尸体装入专用的医疗废物垃圾袋，密封后送至有资质的医疗废物处理机构进行无害化处理，不得随意丢弃或作为其他用途。9质量控制与记录管理9.1动物质量检测机构需每年委托具有实验动物质量检测资质的机构，对本单位饲养的实验动物进行至少1次全面质量检测，检测内容包括：遗传质量：按照GB14923的要求，近交系动物采用生化标记法或基因分型法检测，每100只动物抽检不少于10只，确保遗传纯度符合要求；封闭群动物检测遗传杂合度，避免近交衰退。微生物与寄生虫质量：按照GB14922的要求，普通级动物检测沙门氏菌、皮肤真菌、体外寄生虫等项目；SPF级动物检测出血热病毒、仙台病毒、肺炎克雷伯菌、弓形虫等18项微生物和寄生虫项目；无菌级动物检测需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体等项目，全部合格后方可使用。检测报告存入机构实验动物质量档案，保存期限不少于动物使用结束后5年。9.2记录管理所有与实验动物护理和使用相关的活动都需形成完整、可追溯的记录，记录内容包括：设施运行记录：环境参数监测记录、过滤器更换记录、消毒记录、设备维护记录。饲养管理记录：动物引种记录、检疫记录、饲养日志、饲料/饮水采购与检测记录、笼具清洗灭菌记录、健康巡查记录、兽医诊疗记录。实验操作记录：伦理审查文件、动物使用记录、实验操作过程记录、麻醉/镇痛记录、手术记录、安乐死记录、动物尸体处理记录。所有记录需由操作人员签字确认，不得涂改，如需修改需在修改处签字并注明修改日期，纸质记录归档保存，电子记录定期备份，保存期限不少于项目结束后6年，涉及药品、医疗器械注册相关的实验记录，保存期限不少于注册后5年。10生物安全与应急管理10.1生物安全管理开展病原感染类动物实验的机构需取得对应的生物安全实验室资质，实验活动不得超出资质批准的范围。操作高致病性病原的实验需在BSL-3及以上等级的生物安全实验室中进行，操作人员穿戴三级防护装备，实验过程中严格遵守生物安全操作规范，避免病原泄