CN119431745A 制备大分子单体的方法以及由此制得的大分子单体 （百进生物科技公司）

201880049895.42018.07.26制备大分子单体的方法以及由此制得的大本申请涉及制备大分子单体的方法以及由第一和第二反应性基团不同并且能够彼此反应2将多种反应性单体组合以形成反应混合物，其中所述反应性单体的第团不同并且能够彼此反应以形成大分子单体，所述大分子单体的分子量(Mn)为20K至85K，2.根据权利要求1所述的制备大分子单体的方法，其中该方法是在Yamamoto聚合反应3.根据权利要求1所述的制备大分子单体的方法，其中该方法是在Suzuki反应条件下4.根据权利要求1所述的制备大分子单体的方法，其中所述反应混5.根据权利要求1所述的制备大分子单体的方法，其中所述大分子单体包含SqPeg单38.根据权利要求1所述的制备大分子单体的方法，其中所述大分子单体是选自以下组4[0001]本申请是于2018年7月26日提交的发明名称为“共轭聚合物及其使用方法”的第[0003]本申请要求于2017年7月28日提交的第62/538,583号美国专利申请的优先权，其体分子的荧光发射光谱必须与受体发色团的[0008]聚茚芴聚合物或大分子单体具有定义明确的结构、独特的光学性质且是稳定5R2和/或R3和R4与它们所连接的碳一起结合形成任选取代的4、5或6元[0027]与生物分子(例如抗体)缀合的大分子单体可用作例如生物测定(例如免疫测定)[0030]提供与捕获分子缀合的式I或II的大分子单体，其中所述捕获分子能够与所述目标分析物相互作用；述捕获分子和所述缀合大分子单体接触；向所述样品施加激发所述缀合大分子单体的光6猝灭剂分子和根据本公开的大分子单体标记的核酸探针序列。8E显示具有与大分子单体801的共价连接的抗体相互作用的洋地黄毒苷部分的核酸；以及10B显示结合有分析物的生物素标记的一抗，然后加入与大分子单体连接的链霉抗生物素7酯)更易于通过亲核加成和消除而置换的羧基衍生物。活化酯的代表性羰基取代基包括琥8链或支链脂族烃基。优选的烯基具有2至约12个碳原子。更优选的烯基含有2至约6个碳原9者Y1和Y2与将Y1和Y2连接的氮一起结合形成4元氮杂环基至7元氮杂环基(例如哌啶基)。任NRR'杂化的碳原子或具有可以杂化到p轨道中的非共享电子对的其他原C1C9亚烷水溶性基团的水溶性共轭大分子单体使得聚茚并芴大aRb4_C6杂环基是任选取代的吡咯烷基或哌啶基。[0112]在某些方面，C4_C6杂环基被R5取代。R5可以是至少一[0120]在某些情况下，式I或式II的聚茚并芴大分子单体包含至少一个被一个或多个水酯(NHS酯)可以与伯胺反应以形成稳定的酰胺键。马来酰亚胺和硫醇可以一起反应并制备[0132]其中虚线是指R1和R2以及R3和R4二者可以可选地连接以形成任选取代的4元环、5包括一个或多个环氧烷重复单元。例如，水增溶基团可以含有一个或多个乙二醇单元、_OCH3[0142]其中虚线表示R1和R2以及R3和R4二者可以可选地连接以形成任选取代的4元环、5[0153]在某些方面，每个R6独立地为水溶性基团，例如环氧乙烷低聚物甲基醚，例如mPEG550氧乙烷聚合物和用于与分子或生物分子缀合的用于缀合的位点可以是i)用于缀a是取代的酰基_C(O)_CH(NH2)_CH2CH2CH2CH2NH2，其中胺被Boc保2是N_羟基琥珀酰亚胺基。面，环氧乙烷低聚物甲基醚在_O_PEG11_OCH3和_O_PEG550_OCH3之[0197]在某些方面，式I或II的大分子单体(即聚合物)的尺寸可以根据聚合反应中使用II的大分子单体的多分散性可以用多分散性指数(PDI)表示。可以使用以下等式计算PDI：[0202]在某些方面，式I或式II的大分子单体可以表现出以下特性或特征中的一种或多染料125标记的抗体110的生物分子与本公开的大分子单体131反应。本公开的大分子单体如果供体荧光团和受体荧光团彼此非常接近，则能量在供体荧光团和受体荧光团之间转附着到生物分子的染料(例如抗体复合物)具方案中的生物分子组分241可以是本文所述的各种生物分子中的任何一种，包括但不限于单体或生物分子(或染料或染料标记的生物分子)的连接化学可以包括但不限于互补反应大分子单体的示意图300。在某些方面，本公开包括使用这些缀合大分子单体作为直接标二抗体。与抗体缀合的大分子单体可用作例如生物测定(例如免疫测定)中的直接报道分物和目标相关生物分子的生物分子标记的用途。图3B描述了与抗生物素蛋白(例如链霉抗760nm、780nm、800nm、820nm、840nm、860nm、880nm、and/or900nm.Theemissionwavelengthispreferablyaroundabout200一900nmsuchasabout200Br2、BODIPY8530/550、BODIPY8558/568、BODIpyg564/570、BODIPY8576/589、[0219]图4(A)说明根据本公开用染料410和大分子单体407标记的抗体405，其可用于使用UV光413的FRET测定；图4(B)说明用染料420标记并用根据本公开的大分子单体407标记[0220]在本公开的大分子单体与染料(图3D)或生物分子/染料复合物(如图4中所示例)[0221]图5说明描绘测定目标生物分子、分析物或目标相关生物分子的各种方法的示意图。例如，图5(A)显示用染料512连接到与第二抗体515结合的第一抗体501的大分子单体有连接的染料512和生物素531的抗体515以及链霉抗生物素蛋白541与连接到其上的大分子单体510的第二生物缀合物；以及图5(D)说明具有染料512和与其结合的生物素555的核酸562和具有与其缀合的大分子单体510的链霉抗生物素[0223]图7(A)说明描绘具有连接的染料709和生物分子710的大分子单体701和所得能量转移的示意图；图7(B)示出具有缀合链霉抗生物素蛋白715和连接染料709的大分子单体示生物素化抗体815与大分子单体801的共价缀合物804相互作用；图8(B)显示生物素化抗化核酸822与大分子单体的共价部分809相互作用；图8(D)显示与具有连接染料812的大分苷部分831的核酸822和针对大分子单体染料812串联[0226]图9A显示与分析物951结合的一抗905，其中加入了附加有大分子单体915的二抗[0227]图10A显示夹心型复合物，其中一抗1005结合分析物1051。然后加入具有生物素[0228]图10B显示结合有分析物1051的生物素1012标记的一抗1005。加入与大分子单体2873，2001；针对Heck反应方案的Mikroyannidis等人，J.Polym.Sci.PartA:Polym.Chem.45:4661_4670、2007；和针对Sonogashira反应方案的Sonogashira等人，[0236]在某些方面，制备式I或式II的大分子单体的方法包括将多种反应性单体组合以[0238]在某些方面，该方法包括在甲苯和DMF的溶剂混合物中在70℃下加热Ni(COD)2、1_C6硼酸酯个示例性方法中，第一反应性二卤化物单体与具有两个硼衍生物官能团的第二单体聚合。具有至少两个反应性含硼基团的芳族单体和具有至少两个反应性卤化物官能团的芳族单[0246]在某些方面，本文所述的单体经由Suzuk适的可聚合基团的芳族单体(例如芳烃或杂芳烃)添加到反应混合物中可以提供具有包括[0247]下图列出了产生本发明的所需代表性PEG化缀合物的两种代表性反应方案；上面PEG引入到存在于聚合物中的官能团中以增加水溶性。下面提供一些用于改性聚合物的代(24.80当量，351.41mmol)KOH混合。小心地向混合物中加入26.5mL(29.89当量，物保持搅拌12h，然后用氯化铵溶液淬灭并用氯仿(3×50mL)萃取。有机层用无水MgSO4干二氢茚并[1,2b]芴(285mmol)、100mL乙酸和10mL二氢茚并[1,2b]芴(285mmol)、100mL乙酸和10mL甲苯加入烧瓶中并在回流下加热48小时。将反应混合物倒入水中，并且将所得溶液用氯仿(3×50mL)萃取。合并的有机层用稀HNMR在氯仿和甲醇的混合物中进行重结晶，得到1.12g化合物(91％收率)。1HNMR(DMSO,[0300]实施例12说明2,2’(6,6,12,12四(3溴丙基)6,12二氢茚并[1,2b]芴2,850ml无水THF中的混合物中加入NaH(0.6g，25mmol)NaH烧瓶。将混合物在室温下搅拌30分[0308]原料2,7二溴4甲基螺[芴9,4’哌啶]根据美国专利公开号2014/0243283制×2)洗涤收集的有机相。将有机相蒸发至干并通过己烷/EtOAc分离，得到白色棉花固体[0310]实施例15说明2’,7’二溴3,3双(OPEG550甲基醚)螺[环丁烷1,9’芴]将混合物温热至室温并搅拌过夜。蒸发THF后，加入盐水(50mL)，粗产物用二氯甲烷(3×40mL)萃取。将合并的有机层浓缩并通过柱色谱法(DCM一异丙醇)纯化，得到无色油产物二溴3,3双(OPEG550甲基醚)螺[环丁烷1,9’芴](0551，在氮气下，将单体Papeg[0316]然后将上述化合物的聚合物P14溶解在30ml的DCM和30ml的TFA混合物中，然后在器过滤并且通过Amicon②Ultra_4离心过滤器单元(MWCO，30K)(可从EMDMilliporeGEHealthcareLifeSciences)以除去催化剂杂质。通过流过Superose6柱(GELifeSciences)进一步分级纯化的聚合物以缩小尺[0317]采用Yamamoto法和Suzuki法合成了一系列由单体聚乙二醇化芴(SqPEG)和不同含量的聚乙二醇化茚并芴链段组成的新型共聚物。它们的Mn范围为20K_85K。如上所述，[0318]具有SqPeg和PEG化茚并芴链段与Mn的精确含量比的聚合物的示例吸收数据在图[0319]图13表示通过Suzuki聚合制备的聚合物L18的吸收曲线，而图14表示通过[0322]凝胶渗透色谱法(GPC)在THF中在50℃下使用5μm的HR3和HR4GPC柱系统在具有AgilentUV检测器的Agilent1200HPLC分离模块上使用0.5mL/min的流速进行。用Agilent’sEasicalPS_2标准物在580_364,000g/mol[0331]在氩气下，向Schlenk烧瓶中的DMF(6mL)中的实施例12中的CBPeg11(0.273g，物在80℃再加热5小时。在室温下，向20％的EtOH/H2O(20mL)中加入反应混合物EDTA使用20％的EtOH/H2O将过滤的溶液稀释[0332]类似于以上实施例17中的聚合物P14处理聚合物15，然后用于活化和进一步生物[0334]类似于实施例19来制备该化合物，而实施例11中的TBpeg550和实施例18中的[0337]描述了将抗体缀合到聚合物染料上的方法。抗人CD4(UCHT1)或抗_人IFN_γ抗体糖醇)以160：1的摩尔比还原30分钟。将它们纯化并用G_25柱(SephadexG_25Fine，GE的磺基_SMCC(磺基琥珀酰亚胺基4_(N_马来酰亚胺甲基)环己烷_1_羧酸酯，[0339]将100μL的抗凝全血添加至含有荧光团缀合的抗体的管中并温和混合。将试管在室温下在黑暗中孵育15分钟，然后向混合物中直接加入2mL室温1XRBC裂解缓冲液以沉淀细胞。除去上清液，轻轻涡旋试管以松开细胞沉淀，加入2mL的FACS洗涤缓冲液[0341]用与抗CD3抗体偶联的P43或P100聚合物荧光团染色的人溶解的洗涤血样的细胞激光源、488nm蓝色激发激光源、532nm绿色激发激光源和640nm红色激发激光源的BDLSR(图11C)可用于成功鉴定存在于复杂异质细胞混合物例如LWB制剂中的CD3+(UCHT1+)细胞。百分比表示阴性染色细胞群(M1)和阳性染色细胞群(M2)100μ