DB54-T 0686-2026牛羊前后盘吸虫病诊断技术规范

ICS65.020.30CCSB4354IDB54/T0686—2026 2规范性引用文件 3术语和定义 4临床诊断 5病原检查 6聚合酶链式反应PCR诊断 37鉴别诊断 8无害化处理 附录A（资料性）前后盘吸虫虫卵及虫体形态 附录B（资料性）PCR诊断 DB54/T0686—2026本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由西藏自治区农业农村标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所、日喀则市桑珠孜区年木乡农牧综合服务本文件主要起草人：石斌、夏晨阳、赵霞玲、唐文强、任越、单曲拉姆、普琼。1DB54/T0686—2026牛羊前后盘吸虫病诊断技术规范本文件规定了牛羊前后盘吸虫病临床诊断、病原检查方法和聚合酶链式反应诊断方法等技术要求。本文件适用于牛羊前后盘吸虫病的诊断、检疫以及流行病学调查。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。实验室生物安全通用要求《病死畜禽和病害畜禽产品无害化处理管理办法》3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。前后盘吸虫吸虫纲、棘口目、前后盘科的各种吸虫，西藏主要有鹿前后盘吸虫（Paramphistomumcervi）、链肠锡叶吸虫（Orthocoeliumstreptocoelium）、长菲策吸虫（Fischoederiuselongatus）、雷氏前后盘吸虫(Paramphistomumleydeni)、小杯殖吸虫（Calicophoronmicrobothrioides）、扩展盘腔吸虫（Explanatumexplanatum）。3.2前后盘吸虫病由前后盘科各种吸虫寄生于牛、羊等反刍动物的小肠、瘤胃、胆囊和胆管等部位引起的一种寄生虫病。3.3聚合酶链式反应PCR一种在体外扩增DNA片段的方法。当存在模板DNA、底物、上下游引物和耐热的DNA聚合酶时，经过多次“变性-退火-延伸”反应，扩增目的基因片段。4临床诊断4.1临床症状牛发病表现为精神萎靡、身体孱弱、腹泻、食欲不振，短期内体重骤降，眼结膜和口唇粘膜苍白且有出血点，颌间部、胸垂部水肿，鼻镜及鼻翼有浅表溃疡；部分病牛一周内体温升至40.3℃~41.2℃,重症者排带血水样粪便、肋部凹陷。犊牛均有前胃弛缓、疝痛症状，表现为反复卧立，重症犊牛5天至1个月内死亡；犊牛病例多为慢性，无明显体温升高，但眼结膜苍白、颌间部及胸垂部水肿。2DB54/T0686—2026羊发病后食欲废绝、反刍减少，毛发粗糙、身体虚弱、消瘦喜卧，下痢，恶臭血便，眼粘膜泛白、脊背呈弓形，重症者出现顽固性腹泻、极度消瘦、腹部膨胀及颌下水肿。4.2病理变化急性型可见患畜小肠、真胃黏膜水肿，出血，坏死，发生出血性肠胃炎或纤维性炎症，肠黏膜出血、溃疡。慢性型主要呈现胆管和瘤胃上皮细胞增生、瘤胃纤毛消失乳头化，胆管及胆囊炎症、胆管纤维化、胆管扩张及阻塞，虫卵引起肠道炎症等病变。4.3流行特征呈区域性流行，发生在有中间宿主椎实螺、扁卷螺的河流、沼泽及草甸区域，主要在夏、秋季节感染，在秋、冬季节发病；患病牛羊为主要感染源。5病原检查样本采集和处理时应采取必要的预防寄生虫感染的安全措施，穿一次性防护服，佩戴医用外科口罩及手套。实验室检测过程遵循实验室生物安全通用要求的规定。5.1虫卵检查诊断5.1.1材料200mL刻度烧杯，药匙，研磨棒，60目金属筛网，离心管，盖玻片，载玻片，显微镜等。5.1.2方法称取5g新鲜粪便放入烧杯，加入10mL水搅拌研磨至无明显粪团，呈均匀地糊状，继续加水90mL，充分研磨混合后，将滤液过滤到新的烧杯，弃去滤渣，滤液静置30min，弃去上清液，再加水静置15min，直至上清液明亮，弃去上清液，吸取沉淀物置于载玻片上，加盖盖玻片置于显微镜下检查。5.1.3结果判定牛羊前后盘吸虫卵呈灰白色，有透明感，一端有卵盖，卵黄细胞松散地分布在卵囊内，大部分胚细胞在虫卵中部偏后，不充满整个虫卵卵囊，卵囊内可见空隙，大小约为（125~132）μm×（70~80）μm。发现虫卵即可确诊，见附录A的图A.1。5.2虫体检查诊断5.2.1材料解剖刀，手术剪刀，40目金属筛网，挑针，镊子，搪瓷盆，平皿，托盘，生理盐水，载玻片等。5.2.2采集虫体将牛羊尸体放置剖检体位，剖检手术打开腹腔后分别取出小肠，肝脏，瘤胃，置于搪瓷盆内。取出肝脏后观察胆囊和胆管的形态大小，分离胆囊置于大平皿内，延胆囊底部剪开胆囊囊壁，胆汁收集于平皿内，再延大胆管剪开胆囊，收集胆囊和胆管壁上的虫体。瘤胃从幽门向瘤胃背部剪开，轻轻倒出内容物后，生理盐水缓慢清洗瘤胃壁，翻开瘤胃乳头，发现虫体收集于装有生理盐水的平皿内。小肠一端置于金属筛网内，收集肠内容物，用生理盐水灌肠，反复冲洗肠道，直至流出液体清亮，将筛网内收集的内容物放入大平皿内，加入生理盐水稀释，挑出虫体见附录A的图A.2。3DB54/T0686—20265.2.3虫体固定生理盐水清洗虫体表面物体后置于吸水纸上吸干虫体体表水分，置于载玻片中央，调整好体位后，在载玻片两端垫上双层滤纸条，盖上新的载玻片，磨砂面朝外，稍用力压紧虫体后用细线将载玻片两端扎绑，70%酒精溶液固定，固定时间大于24h。5.2.4虫体染色将固定好的前后盘吸虫从70%的酒精取出，吸水纸吸干液体，置于50%酒精、30%酒精和蒸馏水中分别浸泡1h，取出虫体吸干液体，放入染色缸里染色12h，将染色后的前后盘吸虫取出用70%酒精清洗4次，放入酸酒精中30min进行脱色，使用70%的酒精冲洗4次，每次3min~4min，避免有盐酸残留持续脱色，清洗后的虫体依次放入75%、80%、85%、90%、95%、100%（第一次）、100%酒精各30min，将脱色后的虫体置于透明液中10min左右再置于纯丁香油中10min左右，待虫体透明后取出，滴加中性树胶，固定在载玻片上，加盖玻片，阴凉处晾干，显微镜下观察虫体形态。5.2.5结果判断鹿前后盘吸虫成虫虫体圆锥形，体前端稍尖，后端钝圆，米粒大小，略微弯向腹侧，长8.54mm~10.3mm，宽1.75mm~4.44mm；口吸盘大小为（1.mm×（1.62~2.28）mm，见附录A的图A.3。链肠锡叶吸虫成虫体表面平滑，背部弯曲朝向腹部，体长7.84mm~10.5mm，虫体中部最宽可达3.8mm~3.91mm；口吸盘似圆形，大小为（0.72~1.15）mm×（0.64~1.11）mm；腹吸盘大小为（1.76~2.13）mm×（1.68~2.05）mm，见附录A的图A.4。长菲策吸虫成虫虫体类似圆柱形，体前部向前逐渐变小，体中部最宽，体亚末端较大，虫体长4.78mm~5.21mm，宽度最宽为0.98mm~1.83mm；口吸盘大小为（0.36~0.49）mm×（0.33~0.38）mm；腹吸盘呈现半球形，大小为（0.94~1.08）mm×（0.42~0.59）mm，见附录A的图A.5。雷氏前后盘吸虫成虫虫体圆锥形，体前部稍小，体表具有乳头状突起，体长7.10mm~9.2mm，体后部最宽，3.29mm~3.35mm；口吸盘大小为（1.02~1.06）mm×（0.96~1.01）mm；腹吸盘呈现球形，大小为（1.95~2.28）mm×（1.79~1.95）mm，见附录A的图A.6。小杯殖吸虫（Calicophoronmicrobothrioides）成虫虫体呈现长圆锥形，体前段稍小，体后部1/3处最mm；腹吸盘大小为（2.07~2.24）mm×（1.85~2.09）mm（见附录A的图A.7）。扩展盘腔吸虫（Explanatumexplanatum）成虫虫体梨形，虫体前部小，后部宽，体长5.9~7.2mm，体宽2.79mm~4.16mm；口吸盘大小为（0.64~0.8）mm×（0.47~0.58）mm；腹吸盘比口吸盘发达，大小为（1.19~2.15）mm×（1.74~2.03）mm，见附录A的图A.8。6聚合酶链式反应PCR诊断6.1试剂和材料粪便基因组DNA提取试剂盒，TaqPCRMix预混液，1.5%琼脂糖凝胶，50×TAE电泳缓冲液，DL2,000DNAMarker，核酸染料，前后盘吸虫阳性对照：前后盘吸虫基因组DNA（20ng/μL），前后盘吸虫阴性对照：非前后盘吸虫基因组DNA，空白对照：ddH2O，引物序列及试剂（见附录B的表B.1）。离心管，药匙，称量纸，PCR管，500mL量筒，500mL锥形瓶，枪头，记号笔等。6.2方法4DB54/T0686—20266.2.1粪样采集与处理检测过程中不得直接接触待检样品，无交叉污染。a)每头/只牛羊采集5g新鲜粪便放入玻璃杯中，加50mL水搅成糊状，经充分混合后，用60目铜丝筛网滤入另一玻璃杯中，把滤过的粪便混悬液自然静置沉淀30min，弃去上清液，吸取沉淀物放入一个1.5mL离心管中，使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品中的全基因组。b)采集的样品宜当天处理和检测，若不能当天检测，应暂时放于冰箱冷冻室-20℃保存，若需长期保存，应放置于-80℃超低温冰箱。c)使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便样品中的全基因组。d)提取好的全基因组置于4℃保存，若不能当天检测，应放于冰箱冷冻室-20℃保存。6.2.2PCR扩增ddH2O8.5μL（见附录B的表B.1）。6.2.3凝胶电泳用TAE电泳缓冲液配制成1%琼脂凝胶。将琼脂凝胶放入电泳槽中，加入TAE电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。琼脂糖凝胶板的加样孔中第一孔加入5μL的DL2,000DNAMarker，其余加样孔加入阴性对照和8μL的PCR扩增产物。150V电压条件下电泳，直至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶中部。利用凝胶成像系统观察电泳结果并记录。6.2.4结果判定根据凝胶电泳结果判断。a）质控对照成立条件下，凝胶结果显示阳性样品均扩增出大约450bp的单一条带（参见附录B的图b）质控对照成立条件下，样品不出现特异性条带为阴性。7鉴别诊断诊断满足GB19489-2008实验室生物安全通用要求，根据流行病学史、临床症状以及实验室检查结果进行诊断，应与片形吸虫病相鉴别。片形吸虫成虫虫体为“柳叶形”的片状，与前后盘吸虫区别较大；片形吸虫虫卵呈长卵圆形，前端较窄，颜色为黄褐色至深黄色，有一个不明显的卵盖，后端较钝。卵壳较薄，双层，卵内充满卵黄细胞和一个胚细胞，虫卵大小为（116~190）μm×（66~90）μm。8无害化处理8.1粪便处理圈舍粪便及时清理，羊粪用作燃料或者堆积发酵处理，杀死粪便中的寄生虫和虫卵。8.2病料处理牛羊尸体及废弃物按《病死畜禽和病害畜禽产品无害化处理管理办法》规定执行。5DB54/T0686—2026（资料性）前后盘吸虫虫卵及虫体形态图A.1前后盘吸虫虫卵图A.2前后盘吸虫虫体图A.3鹿前后盘吸虫图A.4链肠锡叶吸虫图A.5长菲策吸虫图A.6雷氏前后盘吸虫图A.7小杯殖吸虫图A.8扩展盘腔吸