生物制品溴化物测定指南（试行）

生物制品溴化物测定指南（试行）本指南适用于疫苗、抗毒素及抗血清、血液制品、重组蛋白类制品、基因治疗产品、细胞治疗产品、体外诊断试剂核心原料等各类生物制品的原液、半成品、成品，以及生产过程涉及的工艺中间体、原辅料、工艺用水中溴化物的定性与定量测定。本指南规定的测定方法中，离子色谱法为仲裁方法，适用于溴化物残留的精准定量；电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES法）适用于总溴含量的批量快速测定；比色法适用于生产现场的快速筛查，阳性结果需经仲裁法确认。

规范性引用文件

《中华人民共和国药典》2025年版三部通则，GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》，GB/T30903-2014《无机化工产品杂质元素的测定电感耦合等离子体发射光谱法》，HJ84-2016《水质无机阴离子（F⁻、Cl⁻、NO₂⁻、Br⁻、NO₃⁻、PO₄³⁻、SO₃²⁻、SO₄²⁻）的测定离子色谱法》。

术语和定义

1.溴化物：本指南中溴化物分为可溶性溴化物与总溴两类，可溶性溴化物指供试品中以游离溴离子形态存在的无机溴化物；总溴指供试品中所有含溴化合物经消解处理转化为溴离子后的总含量。

2.检出限（LOD）：指按照既定方法重复测定空白样品，所得测定值标准偏差的3倍对应的溴化物浓度。

3.定量限（LOQ）：指按照既定方法重复测定空白样品，所得测定值标准偏差的10倍对应的溴化物浓度，且该浓度下加标回收率需满足80%-120%、相对标准偏差（RSD）≤10%的要求。

方法原理

1.离子色谱法（仲裁法）：可溶性溴化物测定时，供试品经除蛋白、去除杂质等前处理后，通过阴离子交换色谱柱实现溴离子与其他阴离子的分离，经抑制型电导检测器测定响应值，以保留时间定性、外标法定量；总溴测定时，供试品经微波消解或干法灰化将有机结合态溴转化为无机溴离子后，按上述流程测定。

2.ICP-OES法：供试品经微波消解、干法灰化处理后，所有形态的溴转化为可溶性溴离子，样品溶液经雾化进入氩等离子体中，溴原子被激发后发射出特征波长的电磁辐射，特征辐射强度与样品中溴的浓度呈正相关，通过与标准曲线比对定量。该方法可直接测定总溴含量，单次测定可同时完成多种元素的同步分析。

3.比色法：供试品中的溴离子在酸性介质中被氯胺T氧化为游离溴，游离溴与品红-亚硫酸试剂发生加成反应生成玫瑰红色的三苯甲烷类衍生物，在590nm波长处的吸光度与溴离子浓度呈正相关，通过与标准曲线比对定量。该方法无需大型仪器，适用于现场快速筛查。

试剂与材料

1.试验用水：符合GB/T6682规定的一级水，电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃），本底溴含量≤0.005mg/L。

2.通用试剂：

（1）硝酸：电子级或优级纯，本底溴含量≤0.01mg/L；

（2）过氧化氢：优级纯，浓度30%，本底溴含量≤0.01mg/L；

（3）碳酸钠：优级纯，本底溴含量≤0.05mg/kg；

（4）碳酸氢钠：优级纯，本底溴含量≤0.05mg/kg；

（5）氢氧化钾：优级纯，本底溴含量≤0.05mg/kg；

（6）三氯乙酸：优级纯，本底溴含量≤0.1mg/kg；

（7）乙酸锌：优级纯，本底溴含量≤0.1mg/kg；

（8）亚铁氰化钾：优级纯，本底溴含量≤0.1mg/kg；

（9）硫酸：优级纯，本底溴含量≤0.05mg/kg。

3.标准物质：溴离子标准储备液（有证标准物质，浓度1000mg/L，扩展不确定度≤1%，k=2），4℃密封保存，有效期12个月。

4.离子色谱专用试剂：

（1）碳酸盐体系淋洗液：准确称取2.542g无水碳酸钠、0.840g碳酸氢钠，用水溶解并定容至1000ml，得到浓度为24mmol/L碳酸钠、10mmol/L碳酸氢钠的混合淋洗液，0.22μm水系滤膜过滤后超声脱气15min，常温密封保存有效期1个月；

（2）氢氧根体系淋洗液：准确称取1.122g氢氧化钾，用水溶解并定容至1000ml，得到20mmol/L氢氧化钾溶液，0.22μm水系滤膜过滤后超声脱气15min，氮气密封保存有效期2周；

（3）再生液：50mmol/L硫酸溶液，量取2.8ml浓硫酸缓慢加入1000ml水中，冷却后密封保存有效期3个月。

5.ICP-OES专用试剂：1%硝酸溶液，量取10ml硝酸缓慢加入990ml水中，摇匀后现用现配。

6.比色法专用试剂：

（1）硫酸溶液（1+3）：量取1体积浓硫酸缓慢加入3体积水中，冷却后备用；

（2）品红-亚硫酸溶液：称取0.1g碱性品红，溶于100ml80℃热水中，冷却后取上层清液，加入10ml100g/L亚硫酸钠溶液、1ml浓盐酸，用水稀释至200ml，置于棕色瓶中4℃避光保存，放置12h后使用，有效期1个月，若溶液呈粉色需重新配制；

（3）1g/L氯胺T溶液：称取0.1g氯胺T，用水溶解并定容至100ml，现用现配。

7.材料：0.22μm水系聚醚砜滤膜，离子色谱前处理专用固相萃取小柱（OnGuardRP柱、OnGuardAg柱、OnGuardNa柱、OnGuardBa柱），微波消解专用聚四氟乙烯消解罐，石英坩埚，10ml、25mlA级容量瓶，1ml、5mlA级移液管。

仪器设备

1.离子色谱仪：配备阴离子交换色谱柱（推荐DionexIonPacAS19、AS23或等效柱，柱效≥15000理论塔板数）、抑制型电导检测器、柱温箱、自动进样器，仪器基线噪音≤0.5nS/cm；

2.ICP-OES仪：配备水平观测系统、耐酸进样系统、雾化室、雾化器，波长范围覆盖150nm-800nm，波长分辨率≤0.009nm，短期稳定性RSD≤1%；

3.分析天平：感量0.1mg，经检定合格；

4.微波消解仪：最高工作温度≥220℃，控温精度±5℃，配备泄压安全装置；

5.马弗炉：最高工作温度≥1000℃，控温精度±20℃；

6.高速冷冻离心机：最高转速≥15000r/min，控温精度±1℃；

7.恒温水浴锅：控温范围20℃-100℃，控温精度±1℃；

8.超纯水仪：出水电阻率≥18.2MΩ·cm（25℃）；

9.pH计：测量精度±0.01pH单位，经检定合格；

10.紫外-可见分光光度计：波长范围300nm-800nm，吸光度精度±0.001Abs。

所有仪器设备需按检定校准规程定期校验，使用前确认处于正常工作状态。

供试品前处理

前处理基本原则

前处理过程需全程避免含溴试剂污染，所有器皿经10%硝酸浸泡24h后，用超纯水冲洗3次以上方可使用；每批次前处理需同步做2份空白对照，空白值需低于定量限的1/3。

离子色谱法前处理

1.可溶性溴化物前处理：

①低基质样品（重组蛋白含量≤1g/L的缓冲液、工艺用水、疫苗稀释液、眼用生物制品等）：准确量取1.0ml供试品，置于10ml容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀后过0.22μm水系滤膜，弃去前3ml初滤液，续滤液再过预先活化的OnGuardRP柱（活化方法：依次用5ml甲醇、10ml水冲洗，静置30min），弃去前3ml流出液，收集续滤液待测。若供试品中氯离子浓度≥1000mg/L，需在过RP柱后再过OnGuardAg柱去除氯离子；若硫酸根浓度≥500mg/L，需再过OnGuardBa柱去除硫酸根；

②中高基质样品（血液制品、抗毒素、重组蛋白含量>1g/L的原液、半成品等）：准确量取1.0ml供试品，置于15ml离心管中，加入2ml100g/L三氯乙酸溶液，涡旋振荡1min，静置10min使蛋白完全沉淀，12000r/min4℃离心15min，取全部上清液，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.5，转移至10ml容量瓶中加水定容，摇匀后按低基质样品的滤过、固相萃取流程处理后待测；

③含佐剂、细胞碎片的复杂基质样品（铝佐剂疫苗、细胞裂解液、病毒收获液等）：准确量取1.0ml供试品，加入1ml219g/L乙酸锌溶液、1ml106g/L亚铁氰化钾溶液，涡旋振荡1min，8000r/min离心10min去除沉淀，取上清液按中高基质样品流程处理后待测。

2.总溴前处理：准确称取0.5g（精确至0.0001g）供试品置于微波消解罐中，加入5ml硝酸、2ml30%过氧化氢，密封后静置30min，放入微波消解仪中按以下程序消解：120℃升温5min，保持5min；160℃升温5min，保持10min；190℃升温5min，保持20min。消解完成后自然冷却至室温，打开消解罐置于100℃水浴赶酸30min，冷却后将消解液转移至25ml容量瓶中，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0±0.5，加水定容至刻度，摇匀后过0.22μm滤膜待测。含油量高的供试品可适当延长消解时间或增加硝酸用量。

ICP-OES法前处理

准确称取0.5g（精确至0.0001g）供试品置于微波消解罐中，加入5ml硝酸、2ml30%过氧化氢，密封静置30min后按上述微波消解程序消解，冷却后赶酸至剩余溶液约1ml，转移至25ml容量瓶中，用1%硝酸溶液定容至刻度，摇匀后待测。同步做空白对照。

比色法前处理

与离子色谱法可溶性溴化物前处理流程一致，处理后溶液pH需控制在2-3之间。

测定步骤

1.离子色谱法（仲裁法）

（1）色谱条件设定：采用氢氧根体系淋洗液时，色谱柱为AS19，柱温30℃，淋洗液浓度20mmol/LKOH，流速1.0ml/min，抑制器电流45mA，进样量25μL，运行时间15min；采用碳酸盐体系淋洗液时，色谱柱为AS23，柱温30℃，淋洗液浓度24mmol/LNa₂CO₃+10mmol/LNaHCO₃，流速1.0ml/min，抑制器电流60mA，进样量25μL，运行时间20min。溴离子的理论保留时间为8min±0.5min（AS19柱）或12min±0.5min（AS23柱）。

（2）标准曲线制备：将溴离子标准储备液用水逐级稀释，得到浓度为0.05mg/L、0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的系列标准工作溶液，按上述色谱条件从低到高依次进样，每个浓度重复进样2次，记录峰面积，以峰面积均值对浓度进行线性回归，要求线性相关系数r≥0.999，否则需重新配制标准系列或调整仪器参数。

（3）供试品测定：依次进样空白溶液、供试品溶液，每个样品重复进样2次，记录保留时间和峰面积。若供试品中溴离子浓度超出标准曲线线性范围，需稀释后重新测定。

（4）定性判定：供试品溶液中目标峰的保留时间与标准品保留时间的相对偏差≤2%，且空白溶液中无对应峰，可判定为溴离子峰；若存在疑似干扰峰，可通过加标试验确认，加标后目标峰峰高增加且无肩峰，分离度≥1.5则判定为无干扰。

2.ICP-OES法

（1）仪器条件设定：射频功率1300W，等离子气流量15L/min，辅助气流量0.5L/min，载气流量0.7L/min，观测高度15mm，观测方式为水平观测，分析波长优先选择700.521nm（干扰少，无需真空紫外通道），次选154.065nm（灵敏度高，需配备真空紫外系统），积分时间5s，每个样品重复测定3次。

（2）标准曲线制备：将溴离子标准储备液用1%硝酸溶液逐级稀释，得到浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、2.0mg/L、10.0mg/L、50.0mg/L的系列标准工作溶液，按上述仪器条件依次进样，记录特征发射强度，以发射强度均值对浓度进行线性回归，要求线性相关系数r≥0.995，否则需重新配制标准系列或调整仪器参数。

（3）供试品测定：依次进样空白溶液、供试品溶液，记录发射强度。若供试品浓度超出线性范围，用1%硝酸溶液稀释后重新测定。

（4）干扰校正：若选择154.065nm作为分析波长，存在碳154.073nm的谱线干扰，需采用仪器自带的干扰校正公式扣除背景；若样品中盐分含量≥1%，需采用标准加入法定量，消除基质效应。

3.比色法

（1）标准曲线制备：取6支25ml比色管，分别加入0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml的10mg/L溴离子标准工作液，加水定容至5ml，分别加入2ml硫酸溶液（1+3），摇匀后加入0.5ml品红-亚硫酸溶液，摇匀后加入0.5ml1g/L氯胺T溶液，充分摇匀后置于25℃水浴避光显色20min，在590nm波长下用1cm比色皿测定吸光度，以吸光度值对溴离子浓度进行线性回归，要求线性相关系数r≥0.990。

（2）供试品测定：取5ml处理后的供试品溶液置于25ml比色管中，按上述流程显色后测定吸光度，同步做空白对照。若供试品吸光度超出线性范围，稀释后重新测定。

结果计算

溴化物含量按以下公式计算：

式中：

X——供试品中溴化物的含量，单位为mg/L（液体供试品）或mg/kg（固体供试品）；

ρ——供试品溶液中溴离子的浓度，单位为mg/L；

ρ0——空白溶液中溴离子的浓度，单位为mg/L；

V——供试品溶液的定容体积，单位为ml；

f——供试品的稀释倍数；

m——供试品的取样量，单位为ml（液体）或g（固体）。

结果保留要求：当溴化物含量≥1.0mg/L时，保留3位有效数字；当含量<1.0mg/L时，保留2位有效数字；当含量低于检出限时，报告为“<检出限（对应数值）”。

方法学验证要求

1.检出限与定量限：离子色谱法可溶性溴化物检出限为0.01mg/L，定量限为0.05mg/L；总溴测定检出限为0.02mg/L，定量限为0.1mg/L。ICP-OES法总溴检出限为0.05mg/L，定量限为0.2mg/L。比色法检出限为0.1mg/L，定量限为0.5mg/L。检出限、定量限需每6个月验证一次，或在更换试剂、调整仪器参数后重新验证。

2.精密度：同一供试品平行制备6份待测溶液，分别测定溴化物含量，计算相对标准偏差（RSD），要求离子色谱法RSD≤3%，ICP-OES法RSD≤5%，比色法RSD≤8%。

3.准确度：在供试品中加入低、中、高三个浓度水平的溴离子标准品（分别为定量限浓度、标准曲线中间浓度、标准曲线上限浓度的80%），每个浓度平行制备3份，计算加标回收率，要求离子色谱法回收率为90%-110%，ICP-OES法回收率为85%-115%，比色法回收率为80%-120%。

4.特异性：在空白基质中加入10倍限量浓度的常见干扰阴离子（氯离子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、氟离子），测定溴化物含量，干扰物引起的测定偏差≤5%则判定为特异性符合要求，溴离子与相邻干扰峰的分离度≥1.5。

5.稳定性：处理后的供试品溶液室温放置24h内测定，含量变化RSD≤3%，否则需现处理现测。

限值要求

根据生物制品的类型与工艺特点，溴化物残留需满足以下要求：

1.未使用含溴工艺（未添加溴化钠、溴化钾、溴化氢、溴化氰等含溴工艺助剂）的生物制品，成品中溴化物本底值≤2mg/L，超出限值需开展质量风险评估，排查工艺污染来源。

2.使用含溴工艺的生物制品：

（1）血液制品（人血白蛋白、静注人免疫球蛋白等）、抗毒素类制品，成品中溴化物残留≤50mg/L；

（2）疫苗类制品（含佐剂疫苗、重组亚单位疫苗等），成品中溴化物残留≤10mg/L；

（3）细胞治疗产品、基因治疗产品，成品中溴化物残留≤5mg/L；

（4）眼用、吸入用生物制品，成品中溴化物残留≤20mg/L；

（5）重组蛋白酶类制品（如溶栓酶、胃蛋白酶等），溴化物残留≤100mg/L。

生产过程中间品、原辅料的溴化物限值由企业根据工艺耐受能力自行制定，不得影响成品质量。

质量控制要求

每批次测定需满足以下质量控制要求，否则测定结果无效：

1.空白对照：空白溶液中溴化物含量≤定量限的1/3，无明显干扰峰；

2.质控样：每10份供试品插入1份质控样（有证标准物质或加标质控样），质控样测定值与标示值的相对偏差≤10%；

3.平行样：同一供试品平行测定2次，结果的相对偏差≤10%；

4.加标回收：每批次试验至少做1份加标回收试验，回收率需符合方法学要求。

异常情况处理

1.离子色谱异常：

（1）基线噪音高、漂移大：检查淋洗液是否脱气充分、抑制器是否需要再生、色谱柱是否被污染，可通过冲洗色谱柱、更换淋