生物制品亚硝酸盐测定指南（试行）

生物制品亚硝酸盐测定指南（试行）1适用范围本指南适用于疫苗类（灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白疫苗、多糖疫苗、mRNA疫苗、病毒载体疫苗等）、抗毒素/抗血清类、血液制品类（人血白蛋白、静注人免疫球蛋白、凝血因子类等）、重组治疗性生物制品类（单克隆抗体、双特异性抗体、融合蛋白等）、细胞与基因治疗产品类等生物制品的亚硝酸盐（以NO₂⁻计）含量测定，不适用于处方中明确添加亚硝酸盐作为稳定剂、防腐剂等辅料的生物制品检测。本指南规定的仲裁方法为格里斯试剂比色法，离子色谱法可作为快速筛查及基质干扰场景下的补充检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《中华人民共和国药典》2025年版三部GB5009.33-2021食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定WHO《生物制品质量控制实验室操作规范》JJG178-2007紫外、可见、近红外分光光度计检定规程JJG823-2014离子色谱仪检定规程3术语和定义3.1亚硝酸盐：本指南中所指亚硝酸盐为生物制品生产及储存过程中产生的游离亚硝酸根离子（NO₂⁻），检测结果以NO₂⁻的质量浓度计，单位为μg/mL。3.2基质效应：样品中除目标物以外的其他组分对检测结果的干扰效应，可表现为信号增强或信号抑制。3.3检出限（LOD）：在既定检测条件下，能够定性检出目标物的最低浓度，对应信噪比≥3。3.4定量限（LOQ）：在既定检测条件下，能够准确定量目标物的最低浓度，对应信噪比≥10，且回收率在80%-120%范围内、精密度RSD≤10%。4检测原理4.1格里斯试剂比色法（仲裁法）在pH4.0-5.5的弱酸条件下，样品中的亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应生成重氮盐，重氮盐进一步与盐酸萘乙二胺偶合生成紫红色偶氮染料，该染料在538nm波长处有最大吸收峰，在一定浓度范围内吸光度与亚硝酸盐含量呈线性相关，通过与标准系列比较定量。4.2离子色谱法（补充法）样品经前处理去除蛋白、脂质、佐剂等杂质后，经0.22μm水系微孔滤膜过滤，通过阴离子交换色谱柱实现不同阴离子的分离，经抑制型电导检测器检测，以保留时间定性，峰面积与亚硝酸盐浓度呈线性相关，通过与标准系列比较定量。5实验室环境与设备要求5.1环境要求检测应在无亚硝酸盐污染的理化分析实验室开展，实验室禁止使用含氮类消毒剂（如含氯消毒剂、铵盐类消毒剂），环境温度控制在20-25℃，相对湿度40%-60%，通风良好，避免阳光直射。试验区域应与微生物检测区域、含氮试剂存储区域物理分隔，防止交叉污染。5.2设备要求5.2.1分析天平：感量≤0.01mg，经过计量校准并在有效期内。5.2.2紫外可见分光光度计：符合JJG178-2007要求，波长示值误差≤±1nm，吸光度示值误差≤±0.002A，配备1cm石英比色皿。5.2.3离子色谱仪：符合JJG823-2014要求，配备抑制型电导检测器、阴离子交换柱（填料为烷醇季铵基键合硅胶或聚合物基质，柱效≥15000理论塔板数）、自动进样器。5.2.4高速冷冻离心机：最大转速≥12000r/min，控温精度±1℃。5.2.5恒温水浴锅：控温范围20-100℃，控温精度±1℃。5.2.6涡旋振荡器：振荡频率≥2000rpm。5.2.7玻璃器皿：所有接触样品、试剂的玻璃器皿（比色管、移液管、容量瓶等）使用前需经1mol/L盐酸浸泡24h，再用无亚硝酸盐超纯水冲洗至少3次，60℃烘干后备用，禁止使用含氮洗涤剂、肥皂清洗玻璃器皿。5.2.8其他：0.22μm水系微孔滤膜、C18固相萃取小柱（100mg/1mL）、银基固相萃取小柱（用于高氯样品除氯）。6试剂与耗材要求所有试剂纯度应为优级纯及以上，试验用水为无亚硝酸盐超纯水（电阻率≥18.2MΩ·cm，25℃），无亚硝酸盐水验证方法：取10mL超纯水，加入2mL混合格里斯试剂，混匀静置15min后无紫红色显色即为合格。6.1格里斯试剂6.1.1试剂A（对氨基苯磺酸溶液）：准确称取0.4000g对氨基苯磺酸，溶于100mL20%（v/v）冰乙酸溶液中，搅拌至完全溶解，转移至棕色试剂瓶中，4℃避光保存，有效期1个月。6.1.2试剂B（盐酸萘乙二胺溶液）：准确称取0.2000g盐酸萘乙二胺，溶于100mL超纯水中，搅拌至完全溶解，转移至棕色试剂瓶中，4℃避光保存，有效期1个月。6.1.3混合格里斯试剂：临用前将试剂A与试剂B按体积比1:1等量混合，混合后试剂24h内有效，超过有效期禁止使用。6.2蛋白沉淀剂6.2.1106g/L亚铁氰化钾溶液：称取106.0g亚铁氰化钾[K₄Fe(CN)₆·3H₂O]，溶于超纯水中定容至1000mL，4℃保存有效期6个月。6.2.2220g/L乙酸锌溶液：称取220.0g乙酸锌[Zn(CH₃COO)₂·2H₂O]，溶于30mL冰乙酸与970mL超纯水的混合液中，定容至1000mL，4℃保存有效期6个月。6.3pH调节试剂6.3.10.1mol/L盐酸溶液：量取9mL优级纯浓盐酸，用超纯水定容至1000mL，摇匀后备用。6.3.20.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g优级纯氢氧化钠，溶于超纯水中定容至1000mL，摇匀后备用。6.4亚硝酸盐标准溶液6.4.1标准储备液（100μg/mL，以NO₂⁻计）：准确称取0.1500g（精确至0.01mg）经110℃鼓风干燥至恒重的优级纯亚硝酸钠，用超纯水溶解后定容至1000mL，摇匀后转移至棕色试剂瓶，4℃避光保存，有效期3个月。如需标定储备液浓度，可采用高锰酸钾滴定法：准确移取20.00mL储备液至锥形瓶，加入20.00mL0.1mol/L高锰酸钾标准溶液、10mL1+1硫酸溶液，加热至70℃，用0.1mol/L草酸钠标准溶液滴定至溶液红色褪去，根据滴定体积计算储备液实际浓度，标定误差应≤±2%。6.4.2标准工作液（1μg/mL，以NO₂⁻计）：临用前准确移取1.00mL标准储备液，用超纯水定容至100mL，摇匀后备用，工作液配制后4h内有效。6.5离子色谱用淋洗液根据所用阴离子交换柱类型选择淋洗液体系：碳酸盐体系为4.5mmol/L碳酸钠+1.4mmol/L碳酸氢钠混合溶液，经0.22μm滤膜过滤、超声脱气20min后使用；氢氧根体系为20mmol/L氢氧化钾溶液，由淋洗液发生器自动生成或手工配制。7样品采集与保存7.1样品采集应采用无菌、无亚硝酸盐污染的聚丙烯离心管采集样品，每批样品采集量不少于10mL（至少为检测需求量的3倍），采集后立即密封，标注样品名称、批号、规格、生产企业、采样日期、采样人信息。7.2样品保存样品采集后应2-8℃避光运输，送达实验室后24h内完成检测；无法及时检测的样品应置于-20℃避光冻存，冻存期不超过7d，禁止反复冻融，冻融次数不得超过1次。8检测方法8.1格里斯试剂比色法（仲裁法）8.1.1样品前处理根据生物制品基质类型选择对应前处理方法：（1）低基质样品：适用于灭活疫苗、减毒活疫苗、多糖疫苗等蛋白含量<0.1mg/mL、无佐剂、无脂质成分的样品。准确移取2.00mL样品至10mL容量瓶，用0.1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液调节pH至4.5±0.5，加超纯水定容至刻度，摇匀后待测。如样品含铝佐剂、氢氧化铝佐剂，需先将样品12000r/min4℃离心20min，取上清液后按上述步骤处理。（2）高蛋白基质样品：适用于血液制品、单克隆抗体、抗血清、融合蛋白等蛋白含量≥0.1mg/mL的样品。准确移取2.00mL样品至50mL离心管，加入2.00mL106g/L亚铁氰化钾溶液，涡旋混匀30s，再加入2.00mL220g/L乙酸锌溶液，涡旋混匀30s，静置10min沉淀蛋白，10000r/min4℃离心15min，取全部上清液调节pH至4.5±0.5，转移至10mL容量瓶定容至刻度，摇匀后待测。（3）含脂质基质样品：适用于mRNA疫苗、脂质体包裹的基因治疗产品等含脂质成分的样品。准确移取2.00mL样品至50mL离心管，加入1.00mL色谱纯甲醇，涡旋混匀2min破乳，10000r/min4℃离心10min，取上清液后按高蛋白基质样品前处理步骤操作。（4）细胞治疗产品：适用于CAR-T、NK细胞等细胞注射液产品。将样品3000r/min4℃离心5min，取全部上清液后按高蛋白基质样品前处理步骤操作。8.1.2标准曲线制备取7支10mL比色管，分别准确移取0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL亚硝酸盐标准工作液（对应NO₂⁻含量分别为0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00μg），各管补加超纯水至2.00mL，分别加入2.00mL混合格里斯试剂，涡旋混匀30s，25℃避光静置显色15min（环境温度低于20℃时需置于25℃恒温水浴中显色，高于30℃时显色时间调整为10min）。用1cm石英比色皿，在538nm波长处，以0浓度管为空白对照测定各管吸光度，以吸光度为纵坐标、NO₂⁻质量（μg）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数R²应≥0.999，否则重新制备标准曲线。8.1.3样品测定准确移取2.00mL前处理后的待测液至10mL比色管，加入2.00mL混合格里斯试剂，与标准曲线同条件显色、测定吸光度，代入线性回归方程计算得到待测液中NO₂⁻的质量m（μg）。每批次样品应同时开展平行样测定（2份平行）、基质加标回收试验（高中低3个浓度水平，加标量分别为0.2、0.5、0.8μg）、试剂空白试验。平行样相对偏差应≤5%，加标回收率应在90%-110%范围内，试剂空白吸光度应≤0.005A，否则本次试验结果无效。如样品显色后吸光度超过标准曲线最高浓度点对应吸光度，应将前处理后的待测液用超纯水适当稀释后重新测定，稀释倍数不得超过10倍，稀释倍数超过10倍时应调整取样量重新前处理。如样品本身带有颜色，应同步测定样品空白：取2.00mL待测液加入2.00mL20%冰乙酸溶液代替格里斯试剂，同条件测定吸光度，计算时扣除样品空白吸光度。8.2离子色谱法（补充法）8.2.1样品前处理按8.1.1要求完成样品前处理后，取2mL上清液过0.22μm水系微孔滤膜，再过C18固相萃取小柱（活化方法：依次用3mL甲醇、3mL超纯水活化），弃去前3mL流出液，收集后续流出液待测。如样品中氯离子浓度≥100μg/mL，需额外过银基固相萃取小柱去除氯离子，避免干扰。8.2.2色谱条件阴离子交换柱：DionexIonPacAS19（250mm×4mm）或等效柱；柱温30℃；淋洗液：20mmol/L氢氧化钾溶液，流速1.0mL/min；抑制器电流50mA；进样量25μL；运行时间15min，亚硝酸盐保留时间约为7.8min。8.2.3标准曲线制备用超纯水配制NO₂⁻浓度分别为0、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00μg/mL的标准系列溶液，按上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标、NO₂⁻浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，计算线性回归方程，相关系数R²应≥0.999。8.2.4样品测定将待测液按上述色谱条件进样测定，记录亚硝酸盐峰面积，代入回归方程计算待测液中NO₂⁻浓度c（μg/mL）。以保留时间定性，样品峰保留时间与标准品保留时间相对偏差应≤2%，阳性样品需通过加标确证。每批次样品需同时做试剂空白、平行样、质控样测定，试剂空白应无亚硝酸盐检出，平行样相对偏差≤5%，质控样测定值应在标示值的90%-110%范围内，否则试验无效。9结果计算与表述9.1格里斯试剂比色法结果计算样品中亚硝酸盐含量（以NO₂⁻计，μg/mL）按公式（1）计算：X=(m×V₁)/(V×V₂)×f（1）式中：X：样品中亚硝酸盐含量，μg/mL；m：由回归方程计算得到的待测液中NO₂⁻质量，μg；V₁：样品前处理后定容体积，mL；V：样品取样体积，mL；V₂：测定时移取的待测液体积，mL；f：待测液稀释倍数（未稀释时f=1）。9.2离子色谱法结果计算样品中亚硝酸盐含量（以NO₂⁻计，μg/mL）按公式（2）计算：X=(c×V₁)/V×f（2）式中：X：样品中亚硝酸盐含量，μg/mL；c：由回归方程计算得到的待测液中NO₂⁻浓度，μg/mL；V₁：样品前处理后定容体积，mL；V：样品取样体积，mL；f：待测液稀释倍数（未稀释时f=1）。9.3结果表述检测结果保留3位有效数字，低于检出限时表述为“未检出（检出限：XXμg/mL）”。10方法学验证要求本方法在首次使用、更换试剂批号、更换关键设备、基质类型变更时需开展方法学验证，验证指标及要求如下：10.1特异性：取10份对应基质的空白样品（不含亚硝酸盐）按方法测定，结果均低于检出限；向空白样品中加入10倍限量浓度的常见辅料（硝酸钠、氯化钠、蔗糖、甘露醇、吐温80、硫柳汞、铝佐剂等），测定结果干扰率≤5%，即无明显干扰。10.2检出限与定量限：采用空白基质加低浓度标准品的方法测定20次，计算响应值的标准偏差SD，检出限为3×SD，定量限为10×SD。要求格里斯试剂比色法检出限≤0.02μg/mL、定量限≤0.07μg/mL；离子色谱法检出限≤0.01μg/mL、定量限≤0.03μg/mL。10.3线性范围：标准曲线相关系数R²≥0.999，线性范围覆盖从定量限到2倍限量浓度区间。10.4精密度：重复性：同一人员同一批次测定6份平行样品，结果RSD≤5%；中间精密度：不同人员、不同日期各测定6份平行样品，结果RSD≤10%。10.5准确度：高中低3个浓度水平的加标回收率在90%-110%范围内，RSD≤5%。10.6基质效应：采用后加标法评估，基质加标响应值与水相加标响应值的比值在80%-120%范围内为可接受，超出范围时应采用基质匹配标准曲线进行定量。10.7稳定性：样品前处理后室温放置0、2、4、8、12h分别测定，含量变化率≤10%，即前处理后样品12h内稳定。11结果判定检测结果符合对应生物制品质量标准要求的判定为合格，超出限量要求的需重新取样复核，复核结果仍超出限量的判定为不合格。常用生物制品亚硝酸盐限量要求如下：11.1疫苗类：灭活疫苗、重组蛋白疫苗≤0.5μg/mL；减毒活疫苗≤0.3μg/mL；mRNA疫苗、病毒载体疫苗≤0.4μg/mL；11.2血液制品类：人血白蛋白≤0.2μg/mL；免疫球蛋白类、凝血因子类≤0.3μg/mL；11.3治疗性生物制品类：单克隆抗体、双特异性抗体、融合蛋白≤0.3μg/mL；11.4细胞与基因治疗产品类≤0.4μg/mL。12质量控制要求每批次检测需满足以下质量控制要求，否则试验结果无效：12.1试剂空白：格里斯法试剂空白吸光度≤0.005A；离子色谱法试剂空白无亚硝酸盐峰。12.2标准曲线：相关系数R²≥0.999，斜率与历史斜率偏差≤±5%。12.3质控样：每20份样品插入1份已知浓度的质控样，测定值在标示值的90%-110%范围内。12.4平行样：2份平行样测定结果相对偏差≤5%。12.5加标回收：每批次样品同步测定高中低3个浓度的加标回收，回收率在90%-110%范围内。13注意事项13.1严格控制器皿污染：所有接触样品、试剂的器皿必须经过酸浸泡处理，试验前用超纯水冲洗3次以上，避免外源性亚硝酸盐污染导致结果偏高。13.2试剂有效性：混合格里斯试剂需临用前配制，标准工作液需临用前稀释，超过有效期的试剂禁止使用。13.3