ISO 15213-12023 食物链微生物学.梭状芽孢杆菌检测和计数的水平方法.第1部分用菌落计数技术计数减少亚硫酸盐的梭状芽孢菌标准立项发展报告

ISO15213-1:2023《食物链微生物学梭状芽孢杆菌检测和计数的水平方法第1部分：用菌落计数技术计数减少亚硫酸盐的梭状芽孢菌》标准立项发展报告StandardizationDevelopmentReport:Microbiologyofthefoodchain—HorizontalmethodforthedetectionandenumerationofClostridiumspp.—Part1:Enumerationofsulfite-reducingClostridiumspp.bycolony-counttechnique摘要随着全球食品安全监管体系的持续完善，食源性致病微生物的精准检测与计数已成为国际食品贸易和公共卫生防控的关键技术环节。梭状芽孢杆菌（*Clostridium*spp.）作为一类广泛分布于土壤、水源和动物肠道中的厌氧或耐氧芽孢菌属，其减少亚硫酸盐的菌群（sulfite-reducingClostridia）在食品加工及储运过程中的存续与增殖，是衡量食品卫生质量及潜在腐败风险的重要生物学指标。国际标准化组织（ISO）于2023年1月正式发布ISO15213-1:2023标准，该标准隶属于ISO15213系列的水平方法体系框架，重点针对食品及动物饲料中减少亚硫酸盐的梭状芽孢菌，采用菌落计数技术（colony-counttechnique）建立了一整套规范化、可重复、可比较的检测与计数操作流程。本报告系统梳理了该标准的立项背景、技术路线、修订过程、核心内容及其对国际食品微生物检验方法标准化格局的影响。报告指出，ISO15213-1:2023替代并整合了既往ISO15213:2003等相关分散条款，在培养基配方、厌氧培养条件、菌落确认程序及数据处理规则等关键环节实现了技术升级，显著提升了检测方法的特异性与灵敏度。该标准的实施对促进国际食品贸易互认、强化食品安全风险监测能力以及推动我国食品安全国家标准体系的同轨衔接均具有重要的参考价值和现实指导意义。关键词：梭状芽孢杆菌；减少亚硫酸盐梭菌；菌落计数；水平方法；食品微生物学；国际标准化组织；食品安全Keywords:Clostridiumspp.;sulfite-reducingClostridia;colony-counttechnique;horizontalmethod;foodmicrobiology;ISO;foodsafety一、引言食品安全是全球公共卫生治理的核心议题之一。据世界卫生组织（WHO）估计，每年全球约有6亿人因食用受污染食品而罹患食源性疾病，其中微生物性危害占据首要地位。在众多食源性微生物风险因子中，梭状芽孢杆菌属（*Clostridium*）因其芽孢的高度抗逆性而受到特别关注。该菌属包含多种具有医学和食品工业意义的物种，如产气荚膜梭菌（*C.perfringens*）、肉毒梭菌（*C.botulinum*）和艰难梭菌（*C.difficile*）等。然而，在实际食品微生物检验工作中，对全部梭菌种类逐一进行种属鉴定既不经济也不现实。因此，以"减少亚硫酸盐梭菌（sulfite-reducingClostridia）"作为卫生指示菌群的检测策略，在国际食品微生物检验领域被广泛采用。减少亚硫酸盐梭菌是一类能够在亚硫酸盐存在的培养基中将亚硫酸盐还原为硫化氢、并形成特征性黑色菌落的厌氧芽孢杆菌群。该菌群在粪便污染指示、食品加工卫生评价以及罐头食品商业无菌检验中均具有重要地位。标准中"水平方法"（horizontalmethod）概念的提出，意味着该检测方法不限定于某一特定食品基质，而是适用于各类食品和动物饲料，体现了国际标准化组织在方法学层面追求通用性和一致性的技术理念。在此背景下，国际标准化组织食品技术委员会微生物学分会（ISO/TC34/SC9）历经多年工作，于2023年1月16日正式发布了ISO15213-1:2023，首次将减少亚硫酸盐梭状芽孢菌的菌落计数方法从ISO15213:2003的整合版本中独立分册，形成系统化的系列标准第1部分。这一标准化成果不仅回应了全球食品行业对精细化、可追溯检测方法的技术需求，也为各国食品安全监管机构和实验室检测能力的国际互认提供了支撑。二、标准立项背景与行业发展需求2.1梭状芽孢杆菌检测的食品安全意义梭状芽孢杆菌属是一类革兰氏阳性、严格厌氧或耐氧的杆状芽孢菌，在自然界中分布极为广泛。其芽孢结构对热、辐射、干燥及多种化学消毒剂均具有较强的耐受性，常规的食品加工处理（如巴氏杀菌、热烫等）往往难以完全灭活。一旦食品在加工后受到芽孢污染，且储运温度控制不当，芽孢即可萌发并增殖，导致食品腐败变质，甚至产生毒素。在食品微生物学检验中，减少亚硫酸盐梭菌常被用作以下三类指示性指标：第一，作为粪便污染指示菌，与大肠菌群等指标配合使用，评价食品加工环境的卫生状况；第二，作为芽孢菌耐热性的评估指标，用于验证热处理工艺的有效性；第三，作为罐头食品商业无菌检验的重要指标，用于判定低酸罐藏食品是否存在芽孢菌残留增殖风险。2.2国际标准体系的演变与修订需求ISO15213:2003《食品和动物饲料微生物学减少亚硫酸盐梭状芽孢杆菌计数的水平方法》是此前国际上广泛引用的基础性方法标准。然而，随着食品工业技术形态的变革和检验方法学研究的深入，原标准在以下方面逐渐暴露出局限性：-培养基组分和培养条件的描述不够精确，导致不同实验室间的结果可比性不足；-缺乏对干扰菌群和假阳性菌落的鉴别确认指引，影响检测的特异性；-对样品前处理方式和稀释液选择的规定较为笼统，不适用于新型复杂食品基质；-未充分考虑不同食品基质的差异性需求，在乳制品、肉制品、水产制品及婴幼儿食品等不同类别上的适用性有待细化。基于上述原因，ISO/TC34/SC9（食品微生物学分技术委员会）启动了系统的标准修订工作，决定将原ISO15213:2003进行分册重构，形成以ISO15213为总标题的系列标准。自2023年起，该系列分为两部分持续推进：本报告所述的第1部分（ISO15213-1:2023）专注于菌落计数技术，而第2部分（ISO15213-2）则规划了MPN法计数的相关规程，从而在方法学层面形成互补。2.3国际食品贸易与实验室认可的现实需求在国际食品贸易中，不同国家和地区的检测方法和判定标准差异，常构成隐性的技术性贸易壁垒。ISO15213-1:2023的发布为各国统一减少亚硫酸盐梭菌的计数方法提供了权威依据，有助于促进检测结果的国际互认。同时，依据ISO/IEC17025《检测和校准实验室能力的通用要求》获得认可的实验室，在方法选择上需要优先采用国际标准。因此，ISO15213-1:2023的出台直接响应了全球食品安全检测实验室对最新国际标准方法的需求。此外，联合国粮农组织（FAO）与世界卫生组织联合成立的食品法典委员会（CodexAlimentariusCommission,CAC）在制定食品微生物标准时，也需引用相应的标准分析方法。ISO15213-1:2023的发布为CAC相关标准的修订和制定提供了方法学参照。三、标准主要内容与技术解读3.1适用范围ISO15213-1:2023适用于人类消费和动物饲料中减少亚硫酸盐梭状芽孢菌的计数，涵盖各类食品基质，包括但不限于肉类及肉制品、乳及乳制品、水产品、果蔬制品、谷物制品、香辛料、婴幼儿食品和宠物食品等。标准明确说明其水平方法的定位——即在遵循相应特定基质前处理要求的前提下，对各类食品均具有适用性。标准同时规定了检测的限制性条件，包括适用的计数范围和干扰因素排除方法。对于疑似受到严重污染的样品，允许在预增菌步骤中进行适当稀释，以确保菌落计数的准确性和可读性。3.2规范性引用文件与术语定义该标准在编制过程中遵循了ISO/IEC导则的规范框架，系统引用了以下关键标准文件：-ISO6887-1（食品和动物饲料微生物学试验样品、原悬液和十倍稀释液的制备第1部分：微生物检验通用规则）；-ISO7218（食品和动物饲料微生物学微生物检验的一般要求及操作规范）；-ISO11133（食品和动物饲料微生物学培养基的制备和生产、性能测试和质量控制）；-ISO/TS11133-2等相关配套标准。标准对核心术语进行了明确界定，包括：减少亚硫酸盐梭菌（sulfite-reducingClostridiumspp.）、选择性计数（selectiveenumeration）、典型菌落（typicalcolony）、确认（confirmation）等。3.3方法原理ISO15213-1:2023的核心方法原理为：在严格厌氧条件下，将适宜稀释度的样品悬浮液接种于含有亚硫酸盐的选择性培养基（如亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂，SPS琼脂；或亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂，SC琼脂），经37℃±1℃培养20～24小时（必要时延长至48小时），减少亚硫酸盐梭菌在代谢过程中将培养基中的亚硫酸钠还原为硫化钠，硫化钠与培养基中的铁离子（通常为柠檬酸铁铵）反应生成黑色硫化铁沉淀，从而使目标菌落呈现特征性的黑色或深灰色外观。计数采用标准菌落计数原则，选取菌落数在适宜计数范围内（通常为15～300CFU/平板）的培养皿进行计数，并按公式换算为每克或每毫升样品中的菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）。3.4培养基与试剂标准对培养基的组分和配制方法作出了详细规定，关键组分包括：-基础培养基：胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉浸膏等提供氮源和生长因子；-选择性添加剂：多粘菌素B和磺胺嘧啶（或D-环丝氨酸），用于抑制革兰氏阴性菌和部分兼性厌氧菌的生长；-亚硫酸盐指示系统：无水亚硫酸钠作为还原底物，柠檬酸铁铵作为铁离子来源，二者共同构成黑色菌落的显色基础；-琼脂：作为凝固剂，使用浓度为15g/L。标准对培养基的pH值（7.0±0.2）、灭菌条件（121℃±3℃、15min）和质量控制（阳性对照菌株和阴性对照菌株的验证要求）均做了明确规定。3.5操作流程标准规定的操作流程可概括为以下关键步骤：1.样品制备：按照ISO6887-1的规定，无菌称取适量样品，加入适宜稀释液（如0.1%蛋白胨盐水或缓冲蛋白胨水），均质制备初始悬浮液；2.十倍梯度稀释：根据预期污染水平制备连续稀释液；3.接种：采用倾注平板法（pour-platetechnique）或表面涂布法（spread-platetechnique）将适宜稀释度的样液接种于选择性培养基平板；4.厌氧培养：将接种后的平板置于厌氧罐或厌氧工作站中，在37℃±1℃条件下培养20～24小时；5.菌落计数：选取符合计数范围要求的平板，对黑色或深灰色典型菌落进行计数；6.结果确认（可选）：如需要进一步确认，可将典型菌落接种于液体硫乙醇酸盐培养基或进行生化鉴定试验；7.结果计算与表述：按照标准规定公式计算每克（毫升）样品中的减少亚硫酸盐梭状芽孢菌数，以CFU/g（mL）表示，并按ISO7218的规定采用适宜的统计学规则进行数值修约和结果报告。3.6质量控制要求标准在质量控制方面提出了系统的要求：每批次培养基需使用参考菌株（如*Clostridiumperfringens*ATCC13124作为阳性对照）验证培养基的生长支持性能和典型菌落显色特性；同时使用*Escherichiacoli*ATCC25922等作为阴性对照，验证选择性抑制效果。此外，稀释液、培养温度、厌氧条件的逐一验证也是标准操作规范的一部分。四、主要修订单位与标准化工作机构4.1立项与归口机构：ISO/TC34/SC9ISO15213-1:2023由国际标准化组织食品技术委员会微生物学分会（ISO/TC34/SC9）负责起草和归口管理。ISO/TC34/SC9成立于1963年，是国际食品微生物学标准化领域最权威的技术机构，其工作范围涵盖食品和动物饲料微生物检验的所有水平方法标准、垂直方法标准、采样规范以及微生物风险管理相关标准的制修订。SC9目前下设多个工作组（WorkingGroups,WG），分别负责不同主题标准的研制。本标准的修订工作主要由WG2（水平方法）牵头，汇集了来自法国标准化协会（AFNOR）秘书处组织下的各成员国专家。参与标准制定的专家来自国家标准化机构、政府实验室、学术研究机构、食品工业界和独立检测机构，充分体现了多利益相关方共同参与的技术治理模式。4.2主要贡献单位情况介绍在本标准制定过程中，法国标准化协会（AFNOR）及其下属的食品微生物标准化委员会发挥了核心的秘书处和技术支撑作用。法国作为ISO/TC34/SC9秘书处承担国，拥有深厚的食品微生物学标准化传统和丰富的方法学研究积累。法国食品安全局（ANSES）下属的食品实验室（LaboratoiredeSécuritédesAliments）在该标准的技术验证和实验室间协同试验（interlaboratorycollaborativestudy）中提供了关键的数据支撑。与此同时，德国标准化协会（DIN）及其下属的食品微生物标准委员会也深度参与了标准的起草论证工作。德国联邦风险评估研究所（BfR）在梭状芽孢杆菌的致病性和检测方法的专属性评估方面提供了重要的科学依据。中国作为ISO的常任理事国，中国标准化研究院及中国合格评定国家认可中心积极参与了本标准的投票和意见反馈工作。国家标准委组织国内相关专家对标准草案进行了系统评议，并提出了多项技术性反馈意见，部分建议已在最终版本中得到采纳。4.3协同试验与验证工作依据ISO/IEC导则和ISO17468《食品链微生物学参考方法验证和确认的技术要求》的规定，ISO15213-1:2023在正式发布前经历了严格的实验室间协同试验验证。参与验证的实验室遍布欧洲、北美、亚洲和大洋洲，涵盖政府参考实验室、第三方检测机构和食品企业实验室，共计超过20家实验室参与了对多种食品基质（包括巴氏杀菌乳、熟肉制品、冷冻水产、即食蔬菜沙拉和婴幼儿配方食品等）的验证测试。协同试验数据表明，该方法的重复性限和再现性限均满足ISO7218对定量微生物检测方法的精密度要求。五、标准实施应用与行业发展影响5.1对国际食品贸易的积极推动ISO15213-1:2023作为国际公认的水平方法标准，其应用将有力地推动各国在食品微生物安全检测领域的标准互认进程。出口国实验室如能依据该标准出具检测报告，进口国监管部门在风险评估中可优先采信，从而减少重复检测造成的贸易成本和时间损耗。特别是在亚太经济合作组织（APEC）和世界贸易组织卫生与植物卫生措施协定（WTO/SPS）框架下，采用国际标准是促进食品贸易便利化的重要技术基础。5.2对食品安全监管能力的技术支撑该标准提供了一套系统化、规范化的检测技术方案，有助于各国食品安全监管机构统一检测操作、提升检测数据的可靠性和可比性。对于食品安全风险监测、食品加工过程验证和食源性疾病暴发调查等工作，该标准均提供了方法学支撑。5.3对我国食品微生物学标准体系建设的启示我国现行食品安全国家标准中涉及减少亚硫酸盐梭菌检测的方法主要包括GB4789.13—2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》和GB4789.26—2013《食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验》等。上述标准在部分技术条款和操作细节上与ISO15213-1:2023存在差异。在国际贸易和技术交流日益频繁的背景下，积极跟踪并适时转化ISO15213-1:2023的相关技术要求，有助于提升我国食品安全标准与国际标准的对接程度，增强我国在国际食品标准化治理中的话语权。六、结论与展望ISO15213-1:2023的正式发布是国际食品微生物标准化领域的一项重要成果，标志着减少亚硫酸盐梭状芽孢菌计数方法在标准化、精细化和国际化层面迈上了新台阶。该标准在原有ISO15213:2003的基础上，对技术细节进行了系统优化，强化了培养基质量控制、厌氧培养条件、菌落鉴别确认和