外周血干细胞产品质量控制指南（试行）

外周血干细胞产品质量控制指南（试行）一、适用范围本指南适用于经伦理委员会审查批准、在具备相关资质的医疗机构开展的自体/异体外周血干细胞（PeripheralBloodStemCell,PBSC）产品的全流程质量控制，涵盖外周血干细胞动员、单采、分离制备、冷冻保存、复苏放行、临床输注全生命周期环节，同时适用于细胞制备中心、临床科室、质量控制部门的相关操作与管理。非注册临床研究用外周血干细胞产品的质量控制可参照本指南执行。二、规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。《干细胞临床研究管理办法（试行）》（国卫科教发〔2015〕48号）《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》（国食药监办〔2015〕44号）《人源性干细胞产品药学研究与评价技术指导原则（试行）》（2022年第3号）《细胞治疗产品生产质量管理指南（试行）》（2022年第31号）《血液净化标准操作规程（2021版）》GB/T28877《冷冻保存造血细胞的生物学特性检测标准》GB18467《献血者健康检查要求》WS/T541《外周血造血干细胞采集、处理和移植规范》USP<1046>《CellandGeneTherapyProducts》ISO20399《Biotechnology—Generalrequirementsfortheproductionofcellulartherapeuticproducts》三、术语与定义1.外周血干细胞：指通过动员剂将骨髓中的造血干细胞动员至外周血，经单采获得的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞群体，主要以CD34⁺细胞为核心功能标识，可分化为红细胞、白细胞、血小板等各类造血细胞，部分产品可包含同时采集的免疫细胞亚群。2.造血干细胞动员：指通过粒细胞集落刺激因子（G-CSF）等动员剂、配合普乐沙福等辅助药物，促使骨髓中的造血干细胞进入外周血液循环的过程。3.单采产品：使用血细胞分离机采集的供者/患者外周血单个核细胞组分，为外周血干细胞的初始原料。4.终产品：经分离、纯化、富集（或仅经去红细胞、去血浆处理）、分装后的外周血干细胞成品，包括新鲜输注产品和冷冻保存产品。5.质量控制（QC）：指为满足产品质量要求，对原料、过程产物、终产品开展的检验、检测、审核等系列活动，确保每批次产品符合预设质量标准。6.放行检验：指产品完成制备后、临床应用前开展的强制性检验，检验结果符合质量标准后方可用于临床输注。四、全流程质量控制基本要求4.1人员资质要求所有参与外周血干细胞产品制备、质量控制、临床操作的人员需满足以下条件：制备人员：具备细胞生物学或医学相关专业专科及以上学历，接受不少于40学时的细胞制备操作、无菌操作、生物安全专项培训并考核合格，具有不少于10批次的实操经验；检验人员：具备检验专业本科及以上学历，持有临床检验人员资格证，熟悉细胞治疗产品检验标准及操作规程；质量管理人员：具备中级及以上专业技术职称，具有3年以上细胞产品质量管理经验，独立于制备部门；动员及单采操作人员：具备执业医师/护士资格，接受外周血干细胞动员、单采专项培训并考核合格，具有不少于20例单采操作经验。4.2环境与设施要求1.外周血干细胞的分离、制备、分装操作需在B级背景下的A级洁净环境中开展，洁净区环境需按GB50591要求定期监测：静态沉降菌≤1CFU/4h（A级）、≤10CFU/4h（B级），浮游菌≤1CFU/m³（A级）、≤10CFU/m³（B级），悬浮粒子≥0.5μm的粒子数≤3520个/m³（A级）、≤352000个/m³（B级），每周开展1次环境菌检测，每季度开展1次高效过滤器检漏。2.超净工作台、生物安全柜每6个月开展1次质量检测，包括气流速度、悬浮粒子、菌落数，符合A级洁净度要求后方可使用。3.冷冻储存区域需配备24小时温度监控系统，温度波动范围控制在±2℃以内，配备双电路供电及备用发电机，设置超温、断电声光报警，报警信息需同步推送至至少2名管理人员。4.所有接触细胞的耗材、试剂需为无热源、无动物源性的医疗级/试剂级产品，优先选择经NMPA批准的三类医疗器械，同一批次产品需留存供应商资质、质检报告、采购记录，溯源信息至少保留至产品输注后15年。4.3样本溯源要求建立唯一标识的溯源系统，每批次产品需关联以下信息：供者/患者基本信息、动员方案、单采记录、制备过程参数、检验结果、储存位置、输注记录、不良事件记录，所有记录可追溯，纸质及电子档案至少保存30年。五、原料质量控制5.1供者/患者筛查1.异体供者需符合GB18467的献血者健康要求，同时排除以下情况：存在HIV、HBV、HCV、梅毒螺旋体、人类T淋巴细胞白血病病毒（HTLV-I/II）、EB病毒活动性感染、巨细胞病毒（CMV）活动性感染；患有恶性肿瘤、造血系统疾病、自身免疫性疾病活动期、严重心肝肾肺功能障碍；近6个月内接受过器官移植、细胞治疗，近12个月内有纹身、穿耳洞、高危性行为史。2.自体患者需排除以下情况：存在活动性感染、体温≥38.5℃；外周血白细胞计数<2×10⁹/L、血小板计数<50×10⁹/L（动员前基线）；严重肝肾功能异常（谷丙转氨酶/谷草转氨酶>3倍正常值上限、肌酐>1.5倍正常值上限）。3.筛查检测要求：异体供者需在动员前7天内、单采前24小时内分别开展一次病原体检测，自体患者需在单采前7天内开展病原体检测，检测方法采用核酸检测（NAT）联合血清学检测，HIV、HBV、HCV、梅毒检测灵敏度符合国家血站筛查标准，NAT检测下限≤50IU/mL。5.2动员过程质量控制1.动员方案：自体患者常规采用G-CSF5~10μg/kg/d，皮下注射，连续4~5天；异体供者采用G-CSF10μg/kg/d，连续4~5天，必要时第4天联合普乐沙福0.24mg/kg皮下注射。2.动员监测：动员第4天开始每日监测外周血白细胞计数、CD34⁺细胞比例，当外周血CD34⁺细胞比例≥0.5%、白细胞计数升至（20~50）×10⁹/L时启动单采。3.不良反应监测：动员过程中每日记录供者/患者体温、骨痛、乏力等不良反应，若出现白细胞计数>70×10⁹/L、严重骨痛不能耐受、脾脏肿大伴疼痛等情况，暂停动员并评估后续处置方案。5.3单采产品质量控制1.单采设备校准：血细胞分离机每6个月校准1次，每次单采前确认设备运行正常、耗材安装无误，采集参数根据供者/患者体重、血细胞比容预设，处理血量为全血容量的2~3倍（全血容量=体重×70mL/kg）。2.单采过程控制：采集过程中保持血流速度50~70mL/min，密切监测供者/患者血压、心率、血钙水平，若出现口唇麻木、手足抽搐等低钙症状，及时补充葡萄糖酸钙。3.单采产品初检要求：采集完成后2小时内完成以下检测：外观：无溶血、无凝集、无黄疸，容量50~200mL；细胞计数：总有核细胞（TNC）计数≥2×10⁸/kg（受者体重，异体）/≥1×10⁸/kg（自体体重）；CD34⁺细胞比例：≥0.2%；活性：台盼蓝拒染率≥90%；微生物快速检测：采用胶体金法行内毒素检测（<0.5EU/mL）、细菌真菌快速检测阴性。4.单采产品若出现TNC计数不足、CD34⁺比例过低等情况，可次日行二次采集，两次采集的产品可合并制备。六、制备过程质量控制6.1分离制备过程控制1.单采产品需在采集后4小时内转运至制备实验室，转运温度控制在2~8℃，转运箱配备温度记录仪，全程记录温度变化，温度偏差不超过±2℃。2.密度梯度离心分离：采用Ficoll分离液（密度1.077g/mL），离心参数设置为400g、20℃、20min，升降速设置为0，离心后小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，每次离心300g、10min，弃上清去除血小板、红细胞、分离液残留。3.红细胞去除：若单采产品红细胞含量≥5mL，可采用红细胞沉降剂（羟乙基淀粉，终浓度0.5%~1%），室温静置30min后吸取上层细胞悬液，或采用溶血剂处理（0.83%氯化铵溶液，4℃孵育5min），洗涤后去除红细胞残留。4.CD34⁺细胞富集（按需）：针对需纯化的产品，采用免疫磁珠分选系统进行CD34⁺细胞富集，操作严格按照试剂盒说明书开展，富集后CD34⁺细胞纯度≥90%，回收率≥60%。5.过程监测要求：每步操作完成后记录细胞活率、TNC计数、CD34⁺细胞比例，活率低于85%时终止制备，评估产品是否报废。6.2分装及冻存过程控制1.终产品悬液配置：采用含5%~10%人血白蛋白、10%二甲基亚砜（DMSO）的冻存液重悬细胞，细胞浓度控制在（1~5）×10⁷/mL，DMSO终浓度不超过10%，避免细胞毒性。2.分装要求：在A级洁净环境下分装至冻存袋/冻存管中，每袋/管容量不超过50mL，预留至少3支（每支1mL）样本用于放行检验、留样复检。每支样本标注唯一标识，包含产品编号、批次、分装日期、细胞类型、容量。3.程序降温：分装完成后1小时内转入程序降温仪，降温速率设置为：4℃维持10min，以1℃/min降至-40℃，再以5℃/min降至-80℃，维持10min后转入液氮气相（-150℃~-196℃）长期储存。禁止直接将产品置于-80℃冰箱冷冻。4.冻存过程记录：记录程序降温曲线，曲线符合预设参数要求，若出现温度偏差超过±3℃，需评估该批次产品质量，偏差超过10℃的产品直接报废。七、终产品质量控制标准及检验方法7.1必检项目及标准所有批次外周血干细胞产品需完成以下检验，符合标准后方可放行：检验项目质量标准检验方法检验时限外观淡黄色至淡红色均匀悬液，无溶血、无凝块、无肉眼可见杂质自然光下目视观察新鲜产品：制备完成后30min内；冻存产品：复苏后30min内容量标示容量±10%称重法（密度按1.05g/mL换算）同外观总有核细胞计数自体产品：≥2×10⁸/kg（受者体重）；异体产品：≥4×10⁸/kg（受者体重）全自动血细胞计数仪检测同外观CD34⁺细胞计数自体产品：≥2×10⁶/kg（受者体重）；异体产品：≥4×10⁶/kg（受者体重）流式细胞术检测，采用CD45/CD34双标记、7-AAD活率鉴别，计数不少于100个CD34⁺阳性事件制备完成后4小时内/复苏后1小时内细胞活率台盼蓝拒染率≥85%；复苏后产品活率≥80%台盼蓝染色计数法/流式细胞术7-AAD染色法同CD34⁺细胞计数无菌检查细菌、真菌、支原体均阴性细菌真菌采用《中国药典》四部无菌检查法（需同时做需氧菌、厌氧菌、真菌培养，培养14天），支原体采用qPCR法+培养法制备完成后立即取样，培养14天出具正式报告；复苏后产品采用快速微生物检测法（3小时内出结果）内毒素<0.5EU/mL鲎试剂法/动态浊度法制备完成后2小时内/复苏后30min内支原体阴性qPCR法/培养法制备完成后24小时内残留检测BSA残留<50ng/mL；DMSO残留<10%（终产品）；磁珠残留（若富集）<0.1个/细胞ELISA法/高效液相色谱法/流式细胞术制备完成后24小时内HLA分型（异体产品）与受者HLA配型符合（全合/半合匹配要求符合临床方案）Sanger测序法/基因芯片法单采前完成病毒残留（异体产品）HIV、HBV、HCV、梅毒、HTLV-I/II、CMV核酸检测阴性qPCR/NAT检测单采前及制备完成后各检测1次根据临床需求可选择开展以下检测：1.造血祖细胞集落形成试验：CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMM总集落数≥50个/2×10⁵个有核细胞，采用半固体培养基培养14天计数；2.免疫细胞亚群检测：CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD19⁺、CD56⁺细胞比例符合临床方案要求，流式细胞术检测；3.染色体核型分析：正常二倍体核型占比≥95%，G显带法分析，计数至少20个分裂相；4.嵌合率检测（异体移植后监测）：采用STR-PCR法，移植后1个月供者嵌合率≥95%。7.3留样要求每批次产品需留存至少2份检测样本，每份不少于1×10⁶个细胞，一份随产品同条件储存，用于质量异议复检；另一份储存于独立液氮罐中，留存至产品输注后15年。八、储存、复苏与放行质量控制8.1储存过程质量控制1.液氮储存罐每日监测温度2次，温度维持在-150℃以下，液氮液位低于罐体1/3时及时补充液氮；2.每月对储存罐进行环境微生物检测，对液氮及罐内壁表面取样培养，无致病菌生长；3.每季度盘点库存产品，核对产品标识、数量、储存位置，确保账物一致。8.2复苏过程质量控制1.产品复苏需在临床输注前30min内开展，采用37℃水浴快速复苏，复苏过程中不停晃动冻存袋/管，确保1~2min内完全融化；2.复苏后产品立即用含5%人血白蛋白的生理盐水1:1稀释，避免DMSO细胞毒性，稀释后20min内输注；3.复苏后立即取样检测活率、外观、无菌快速检测，活率<70%的产品不得放行。8.3放行审核要求产品放行需由质量受权人签字确认，审核内容包括：1.供者/患者筛查记录符合要求；2.制备过程记录完整，无未解释的偏差；3.所有必检项目结果符合质量标准；4.产品标识正确，溯源信息完整；5.储存、转运过程温度记录符合要求。存在以下情况的产品不得放行：检验结果不符合质量标准；制备过程存在重大偏差且未完成风险评估；标识不清、溯源信息不全；储存过程出现温度超差未评估。九、临床输注与不良事件监测1.输注前核对患者信息、产品标识，确认产品放行记录完整，输注过程采用无滤网的输血器，输注速度初始为10mL/min，观察15min无不良反应后调整为20~30mL/min，总输注时间不