CN119446259A 一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法及装置 （臻和(北京)生物科技有限公司）

一种基于二代测序技术的微卫星不稳定检本发明公开了一种基于二代测序技术的微意组合进行捕获探针设计和/或扩增子引物；选取若干个样本，对每个样本计算其在每个MSI位PCR法判断处于MSI_L或MSS状态的样本作为基线同时应用于杂交捕获和扩增子测序数据的微卫2选取一组重复序列长度均在10_15bp之间的MSI位点，基于所述MSI位点的任意组合进从上述样本中选取若干个被PCR法判断处于MSI_L或MSS状态的样本作为基线样本，对选出MSI状态检测结果为MSI_H的样本，通过计算Spearman秩相关系数判a）将测序得到的碱基序列比对到人类基因组参考序列上，提取完全覆碱基序列的重复序列长度与人类基因组参考序列的相对关系，对测序碱基序列进行分类；提取出每条测序碱基序列上对应MSI位点两翼各三个碱基长度的序列；对于M提取出每条测序碱基序列上对应MSI位点区域的序列；若该段序列中有大于等于两个对捕获测序的样本，按照每条测序碱基序列的起始和终止位点，对于来源于同一DNA原始分子片段的重复测序碱基序列，随机从重复测序碱基序列中a）计算每一基线样本在各MSI位点的相应深度水平下的缺失片段比例和正常片段比计算每个MSI位点在其基线样本中缺失片段比例的3计算每个MSI位点在其基线样本中正常片段比例的7.根据权利要求1所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，其特征在于，Spearman秩相关系数为缺失片段比例和基线缺失片段比例均值设定Spearman秩相关系数的异常阈值，当Spearman秩相关系数大于等于异常阈值时，复序列长度均在10_15bp之间的MS异常样本的基线进行调整并重新判断MSI状态的内容包括：对该样本在每个位点上匹配到求1至9中任意一项所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定4对比肿瘤组织与正常对照样本在这五个微卫星位点上的多态性，可以确认位点是否存在不稳定的情况。若五个微卫星位点中有两个或以上出现微卫星不稳定，则判定为微卫星高度不稳定（MSI_high，MSI_H否则为微卫星低度不稳定（MSI_low，MSI_L）或微卫星稳定选取一组重复序列长度均在10_15bp之间的MSI位点，基于所述MSI位点的任意组从上述样本中选取若干个被PCR法判断为MSI_L或MSS状态的样本作为基线样本，5在其中的一些实施方式中，计算样本的缺失片段比例和正常片段比例的内容包所在区域及两翼至少各两个碱基长度的测序碱基序列；提取出每条测序碱基序列上对应MSI位点区域的序列；若该段序列中有大于等于对于来源于同一DNA原始分子片段的重复测序碱基序列，随机从重复测序碱基序计算每个MSI位点在其基线样本中缺失片段比例的计算每个MSI位点在其基线样本中正常片段比例的6c）计算样本在每个MSI位点上的缺失片段比例和正常片段比例相对于基线的Z_[0015]在其中的一些实施方式中，重复序列长度均在10_15bp之间的MSI位点的数量为[0016]在其中的一些实施方式中，对异常样本的基线进行调整并重新判断MSI状态的内现如上任意一项所述的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法组74个MSI位点，这些MSI位点的重复序列长度均在10_15bp之间；相比重复序列长度大于滤，以减少比对错误对微卫星位点重复序列长度分布的影响，获得更加准确的MSI检测结本发明实施例中，所提供的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法，引入7个位点的稳定状态进行判定，并综合多个位点的稳定状态，对待测样本的MSI状态进行判[0020]图1为本发明一个实施例公开的基于二代测序技术的微卫星不稳定检测方法在捕[0022]下面结合附图，通过具体的实施例及其应用场景对本发明实施例进行详细地说步骤1.选取74个MSI位点用于设计捕获探针或扩增子引物。在进行捕获探针或扩染色体起始位置基因长度染色体起始位置基因长度染色体起始位置基因长度chr10:63760087_63760100ARID5Bchr1:16245610_16245620SPENchr3:78663958_78663972ROBO1chr10:89650474_89650489PTENchr1:181690750_181690763CACNA1Echr4:142950186_142950196INPP4Bchr10:89697373_89697388PTENchr1:243667925_243667937AKT3chr4:187532981_187532995FAT1chr10:89725293_89725304PTENchr1:46597496_46597507PIK3R3chr4:55130161_55130176PDGFRAchr11:108114661_108114676ATMchr22:29674983_29674997EWSR1chr5:44332084_44332094FGF108chr11:108141955_108141970ATMchr22:39637913_39637923PDGFBchr5:67584512_67584524PIK3R1chr11:3381798_3381813ZNF195chr2:209110006_209110016IDH1chr5:79951103_79951114MSH3chr11:94212930_94212941MRE11Achr2:223071111_223071123PAX3chr5:80088493_80088503MSH3chr12:11997693_11997708ETV6chr2:25505023_25505035DNMT3Achr5:86659147_86659158RASA1chr12:11999539_11999550ETV6chr2:42553086_42553096EML4chr6:106534484_106534496PRDM1chr12:124242458_124242471ATP6V0A2chr2:46809063_46809075PIGFchr7:116350757_116350767METchr12:133237753_133237767POLEchr2:46825359_46825370PIGFchr7:140421095_140421107NAchr13:48954159_48954172RB1chr2:46839487_46839498PIGFchr7:140508253_140508266BRAFchr14:38062697_38062709FOXA1chr2:47600881_47600891EPCAMchr7:151884279_151884291KMT2Cchr14:68934755_68934768RAD51Bchr2:47635523_47635536MSH2chr7:50800100_50800115GRB10chr14:68944321_68944332RAD51Bchr2:61308569_61308584KIAA1841chr8:117861112_117861123RAD21chr14:69149592_69149604NAchr3:10094206_10094219FANCD2chr8:117866426_117866436RAD21chr15:88574025_88574035NTRK3chr3:12411792_12411803PPARGchr8:38175279_38175290WHSC1L1chr15:88627317_88627332NTRK3chr3:138400782_138400795PIK3CBchr8:38298093_38298108FGFR1chr15:91303325_91303337BLMchr3:142274739_142274749ATRchr9:87357642_87357652NTRK2chr16:81954996_81955011PLCG2chr3:178937630_178937641PIK3CAchr9:87487518_87487529NTRK2chr17:40647390_40647404ATP6V0A1chr3:185010850_185010860MAP3K13chr9:87513596_87513607NTRK2chr17:66526937_66526947PRKAR1Achr3:30691871_30691881TGFBR2chr9:87641845_87641857NTRK2chr19:50911947_50911959POLD1chr3:33626186_33626201CLASP2chrX:44949951_44949962KDM6Achr1:161309335_161309346SDHCchr3:69988437_69988451MITF步骤2.选取74个MSI位点中的S个。针对每个样本，计算其在每个MSI位点的deletionratio和refe[0026]②提取出每条read上对应MSI位点区域的序列。若这段序列中有大于等于两个碱列长度与人类基因组参考序列的相对关系，对read进行分类1）长度一致：正常9deletionratio和referenceratio，分别记位点s在基线样本中deletionratio的均值和标准差：mean_delsa和;位点s在基线样本中referenceratio的基线均值和标准差：mean__refsa和。a）根据2中所描述的方法，计算样本在S个位点中的每个位点s上的deletion;b）计算每个位点s上的深度ds，根据ds为位点s匹配同等深度水平的基线若且同时满足z__dels之z_cutoff和：位点不稳其中，d__cutoff是MSI位点深度的质控阈值，Z__cutoff是MSI位点的Z_统计不稳定的位点数c_unstable和稳定的位点数c_stable；质控合格的位点数量为passing_loci=c_unstable+c_stable；;若passing_loci≥loci_cutoff且：待测样本为MSS/若passing_loci≥loci_cutoff且msi_score≥score_cutoff：待c_unstable≥c_cutoff其中，loci__cutoff为质控合格位点阈值；score_cutoff为质控位点数量大于等于c__cutoff时msiscore阈值；c__cutoff为质控位点数量低于loci_cutoff时的不稳定位点数阈值。[0036]b)p__cutoff为p的异常阈值。对比p与p__cutoff：若大于等于p__cutoff，说明待测样本与基线在S个MSI位点上的deletion若p小于p__cutoff，说明待测样本与基线在S个MSI位点上的deletionratio②对I中的每一个稳定位点i，计算；其中，del__ratio;是待测样本在位点i的deletionratio，mean-delss,=axmean_delsa,+b，mean_delis,和SD-del:a是位点i[0038]b）使用估计出的参数a和参数b，计算所有S个MSI位点的，用mean_delsas,'替换mean_delss,获得Baselinesa,'；msi_score'。使用细胞系样本22RV1、RL95和GM12878进行混样。其中，GM12878的MSI证样本、181例临床验证样本分别进行建库实验，并使用捕获探针进行杂交捕获。使用序列和低测序质量序列进行去除，并将read剩余部分的序列使用bwa比对到人类参考基因先分别从每一样本在位点s的去重后reads中抽取对应条数的reads，计算67个样本在该深度水平下在位点s的deletionratio和referencer然后计算67个样本在对应深度水平下deletionratio的均值和标准差、[0051]4.使用前一步骤获得②按照步骤4.a所描述的方法，根据去重后的reads计算待测样本在位点s上的deletionratio和refe③按照步骤4.b所描述的方法，根据提取出的reads计算待测样本在位点s上的深④通过步骤4.c中的公式，根据待测样本的deletionrat⑤设置d__cutoff为100、Z__cutoff为4，按照步骤4.d的规则，对待性指真实的MSS/MSI_L样本被检测正确灵敏度进行拟合（如图1所示获得本实施例在捕获测序数据中的检测限（limitof性指真实的MSS/MSI_L样本被检测正确的比例。证实了本实施例能够在临床样本中获得较量捕获测序数据中的性能。从每个样本的双端测序fastq数据中随机抽取75%、50%、25%、0000.5G00.4G00.2G0表5.不同数据量下捕获测序临床验证样本检出性能0000.5G00.4G00.2G1始bam文件中比对在MSI位点上的reads，并用GATKrealigner对这些reads进行再次比对，染色体起始位置基因长度染色体起始位置基因长度染色体起始位置基因长度chr1:161309335_161309346SDHCchr16:81954996_81955011PLCG2chr3:78663958_78663972ROBO1chr1:16245610_16245620SPENchr17:40647390_40647404ATP6V0A1chr4:142950186_142950196INPP4Bchr1:181690750_181690763CACNA1Echr17:66526937_66526947PRKAR1Achr4:55130161_55130176PDGFRAchr1:243667925_243667937AKT3chr2:209110006_209110016IDH1chr5:44332084_44332094FGF10chr1:46597496_46597507PIK3R3chr2:223071111_223071123PAX3chr5:67584512_67584524PIK3R1chr10:63760087_63760100ARID5Bchr2:25505023_25505035DNMT3Achr5:79951103_79951114MSH3chr10:89650474_89650489PTENchr2:42553086_42553096EML4chr5:80088493_80088503MSH3chr10:89697373_89697388PTENchr2:46809063_46809075PIGFchr5:86659147_86659158RASA1chr10:89725293_89725304PTENchr2:46825359_46825370PIGFchr6:106534484_106534496PRDM1chr11:108114661_108114676ATMchr2:46839487_46839498PIGFchr7:116350757_116350767METchr11:108141955_108141970ATMchr2:47600881_47600891EPCAMchr7:140421095_140421107NAchr11:3381798_3381813ZNF195chr2:47635523_47635536MSH2chr7:140508253_140508266BRAFchr11:94212930_94212941MRE11Achr2:61308569_61308584KIAA1841chr7:151884279_151884291KMT2Cchr12:11997693_11997708ETV6chr22:39637913_39637923PDGFBchr7:50800100_50800115GRB10chr12:11999539_11999550ETV6chr3:10094206_10094219FANCD2chr8:117861112_117861123RAD21chr12:124242458_124242471ATP6V0A2chr3:12411792_12411803PPARGchr8:117866426_117866436RAD21chr12:133237753_133237767POLEchr3:138400782_138400795PIK3CBchr8:38175279_38175290WHSC1L1chr14:38062697_38062709FOXA1chr3:142274739_142274749ATRchr8:38298093_38298108FGFR1chr14:68934755_68934768RAD51Bchr3:178937630_178937641PIK3CAchr9:87357642_87357652NTRK2chr14:68944321_68944332RAD51Bchr3:185010850_185010860MAP3K13chr9:87487518_87487529NTRK2chr14:69149592_69149604NAchr3:30691871_30691881TGFBR2chr9:87641845_87641857NTRK2chr15:88574025_88574035NTRK3chr3:33626186_33626201CLASP2chrX:44949951_44949962KDM6Achr15:88627317_88627332NTRK3chr3:69988437_69988451MITF3.使用35例基线样本构建MSI基线完全覆盖位点所在区域及两翼至少各两个碱基长